2014 Fiscal Year Research-status Report
昆虫の摂食行動を支配する生体アミン受容体の網羅的薬理解析と創農薬への展開
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24780113
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
太田 広人 熊本大学, 自然科学研究科, 助教 (60450334)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 昆虫 / 摂食行動 / 生体アミン / 受容体 / 農薬 / カイコ / GPCR / 制御剤 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
カイコから、摂食行動を支配する生体アミン受容体の遺伝子として、14種類（オクトパミン受容体3種類、チラミン受容体2種類、ドーパミン受容体5種類、セロトニン受容体2種類、オーファンアミン受容体2種類）を単離できた。注目すべきは、2種類のcAMP抑制型ドーパミン受容体BmDopR3及び4がクローニングできた点である。このタイプの受容体は昆虫では1種類しか報告がなかったので、非常に興味深い発見である。
ここまでのクローニングに予想以上の時間を費やしたため、行動実験から摂食行動への関与が大きいことが予想されたオクトパミン、ドーパミン、セロトニンの受容体BmOAR1、BmDopR2-4及びBmEcDopR、Bm5HTR2-3の計7種類に絞って、機能解析と薬理解析を進めた。BmOAR1の薬理解析によって、高活性アゴニストの構造的特徴を明らかとし、オクトパミンを超えるアゴニストの創製に成功した。BmDopR2のレポーターアッセイの結果、高活性アンタゴニストをスクリーニングできた。カイコに注射したところ、最もアンタゴニスト活性が強かったメチオテピンに顕著な摂食抑制作用が認められた。BmDopR2は摂食制御剤の標的として利用できると考え、アッセイ系の特許出願を行った。BmDopR3と4は似た受容体であるため、薬理学的性質を比較する実験を進めている。cAMPアッセイでBmEcDopRの機能及びリガンドの同定を行ったが、ドーパミンやそれ以外のアミンに応答しなかったため、解析を中断した。Bm5HTR2の機能同定は完了したので、薬理解析を進めている。Bm5HTR3は発現ベクター作製が難航し機能同定に至っていないため、実験を急ぐ。
以上、解析する受容体をある程度絞り、引き続き、受容体の薬理解析、高活性リガンドの探索と摂食行動への影響を中心に調べていく。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
カイコの生体アミン受容体遺伝子のクローニングに予想以上の時間を費やしたため、以降の機能・薬理解析では、摂食行動への関与が大きいオクトパミン、ドーパミン、セロトニンの受容体BmOAR1、BmDopR2-4及びBmEcDopR、Bm5HTR2-3の計7種類に絞ることで、機能・薬理解析の遅れを取り戻すことにした。BmOAR1の薬理解析では、オクトパミンよりも活性の強いアゴニストを創製するところまで進めることができ、予想以上の進展である。この化合物の摂食行動への影響を現在調べている。BmDopR2に関しては、摂食制御剤の新しい標的として利用できるところまで研究を進展させることができた（特許も1件出願）。他のドーパミン受容体に関して言えば、2種類のcAMP抑制型ドーパミン受容体BmDopR3と4がクローニングできたことは、昆虫生理学上、大きな成果である。BmDopR4の機能・薬理解析が遅れているが、BmDopR3はその機能と薬理性質まで完了させることができた。両者の性質の違いや活性リガンドのスクリーニング、摂食行動解析を今後進める。BmEcDopRに関しては、機能とリガンドの同定が困難であったため、解析を中断した。セロトニン受容体については、Bm5HTR2の機能同定は完了した。Bm5HTR3は発現ベクターの構築が難航し、機能同定にまで至っていないが、引き続き実験を進める。この2種類のセロトニン受容体の薬理性質の違いを調べつつ、活性リガンドの探索と摂食行動への影響を調べていく。
以上、予想以上に研究が進展した受容体もあるが、機能同定・薬理学的性質がまだ完了していない受容体も残っており、全体としては、やや遅れていると判断した。当初は3年間の実験計画だったが、研究期間を1年延長した。
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| Strategy for Future Research Activity |
オクトパミン受容体BmOAR1、ドーパミン受容体BmDopR2-4、セロトニン受容体Bm5HTR2-3の計6種類の受容体に絞った機能・薬理解析を進め、活性リガンドのスクリーニングと摂食行動解析を行っていく。オクトパミン受容体BmOAR1に関しては、レポーターアッセイを用いて、活性リガンドのさらなる探索と新規高活性リガンドの創製を試みる。得られた活性リガンドをカイコに注射し、摂食行動への影響を調べる。ドーパミン受容体BmDopR2に関しては、活性の強かったアンタゴニストに構造的特徴が見られたので、類縁化合物を市販品から探し、レポーターアッセイを行う。BmDopR2は、BmOAR1と分子系統的に近い関係にあり、両者の薬理性質と化合物結合部位の構造との関係には興味が持たれる。そこで、両者の化合物結合部位の構造を部位特異的変異法によって明らかにする。さらに、両受容体に作用する化合物の構造的特徴を計算化学によって評価する。上記アプローチによって、高活性化合物がバーチャルスクリーニングできれば、その化合物の合成にも挑戦する。BmDopR3と4については、薬理性質の比較を進めながら、活性リガンドのスクリーニングと摂食行動実験も並行して行う。セロトニン受容体に関しては、Bm5HTR3の発現ベクターの構築が難航しているため、外注によって問題を解決することも検討し、急ぎ機能同定、薬理解析へと進む。Bm5HTR2との間の薬理性質の違いも見ながら、両受容体の化合物スクリーニングと摂食行動実験を順次進めていく。
活性リガンドを探索するうえで、レポーターアッセイは欠かせないが、cAMP抑制型やCa動員型の受容体にはこのアッセイ系の適用が難しいことが分かってきた。そのような受容体の場合は、検体処理能力は落ちるが、cAMPアッセイやエクオリンCaアッセイを用いる。
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| Causes of Carryover |
14種類のカイコ生体アミン受容体をクローニングし、そのすべての機能解析・薬理解析を実施することを当初予定していたが、クローニングの完了が計画3年目にまで食い込んだため、以降の解析受容体を7種類に絞った。その結果、機能解析・薬理解析にかかる費用が大幅に減少した。高額なレポーターアッセイキットの使用量が当初の予定より少なくなったこと、購入した評価化合物も限定的であったことが主な理由である。以上の理由によって、1,559,508円が残り、それを次年度に繰り越した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
当初3年計画だったが、1年延長の申請をしたので、上記繰り越し分が、本研究の最終的な残予算である。最終年度となる今年度は、6種類の受容体に絞った解析を進める。主な使途として、機能解析及び薬理解析に必要な一般試薬、レポーターアッセイキット、アッセイ化合物などの購入、活性化合物の合成にかかる費用、摂食行動解析に必要な器具・装置の購入、カイコの飼育費用などに加えて、成果報告のための学会参加及び論文投稿にかかる費用に充てることを計画している。
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