2012 Fiscal Year Research-status Report
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24780204
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Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Research Institution | Kagoshima University |
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Principal Investigator |
塩崎 一弘 鹿児島大学, 水産学部, 助教 (70390896)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 糖鎖 |
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| Research Abstract |
魚類におけるシアル酸、およびシアル酸水解酵素であるシアリダーゼの研究はこれまでほとんど行われていない。本研究では魚類におけるシアリダーゼの機能を明らかにすることを目的として、当該年度では以下の項目について近交系メダカHd-rRを用いて検討を行った。
①メダカシアリダーゼのクローニングおよび性状解析…メダカシアリダーゼneu1、neu2、neu3a、neu3b、neu4のうち、クローニングが終了しているneu3a、neu3b以外の遺伝子についてin silicoおよび遺伝子クローニングを行った。ゲノム解析の結果、メダカにはneu2遺伝子は存在せず、neu1およびneu4遺伝子はそれぞれ一つずつ存在することが示唆された。そこで遺伝子クローニングを試みたところ、まずneu4遺伝子のクローニングに成功した。この遺伝子については遺伝子データベースにAccession No：AB774292.1として登録された。また、neu1遺伝子についてはクローニングを継続して行っている。neu4については性状解析も終えており、pH4.6を最適として糖タンパクを基質とすることがあることが分かった。これは糖脂質と糖タンパクの両方を基質とするヒトNEU4とは若干性質が異なっていた。
②メダカ発生段階におけるシアリダーゼ、および糖鎖の発現変化解析…近交系Hd-rRメダカの発生過程におけるシアリダーゼ遺伝子の発現変化を解析したところ、neu3aは受精直後に発現が上昇し、未分化な状態で機能することが推察された。一方、ほかのシアリダーゼは5dpfから8dpfで発現が上昇し、器官形成に関与することが考えられた。
③培養細胞を用いたシアリダーゼの機能解析…神経細胞にneu3a遺伝子を導入したところ、神経突起の進展が認められた。この事から、neu3aは神経細胞の分化に関与し、ネットワーク形成に関与することが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
平成24年度は、1)メダカシアリダーゼのクローニングおよび性状解析、2)メダカ発生段階におけるシアリダーゼの発現変化、3)糖鎖の発現変化解析、培養細胞を用いたシアリダーゼの機能解析、の3つの項目について研究を計画していた。1)については未同定の遺伝子のクローニングおよびデータベース登録、性状解析を完了した。2)については、メダカ胚発生における4つのシアリダーゼ遺伝子(neu1、neu3a、neu3b、neu4)の発現変化について解析を行い、その変動を明らかにするなど順調に計画を達成できた。また、3)については神経細胞にシアリダーゼ遺伝子を導入し、神経突起を進展させるシアリダーゼがneu3aであること、またその機能については哺乳類まで広く保存されていることを明らかにすることができた。
ここまでの研究結果についてまとめたものを、英文雑誌Biochimie誌に投稿し、2012年に受理された（Shiozaki, K., Takeshita, K., Ikeda, M., Ikeda, A., Harasaki, Y., Komatsu, M., Yamada, S., Yamaguchi, K., Miyaagi, T., Molecular cloning and biochemical characterization of two novel Neu3 sialidases, neu3a and neu3b, from medaka (Oryzias latipes). Biochimie, 95, 280-289, 2013)。以上の理由から、本課題は現在まで研究の目的について、当初の計画以上に進展していると評価を行った。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度では遺伝子改変メダカを作成し、数年度に渡り解析を行う予定である。具体的には、以下の計画に従ってメダカシアリダーゼの機能解析を試みる。
a.シアリダーゼトランスジェニックメダカの作製…メダカシアリダーゼの機能をin vivoで解析するため、Hd-rRメダカの受精卵に各シアリダーゼ遺伝子をマイクロインジェクション法により導入し、シアリダーゼ遺伝子のトランスジェニックメダカを作製する。さらに、シアリダーゼの発現解析を行うため、シアリダーゼ遺伝子の5’上流域をGFPなどの蛍光タンパクに繋いだDNAを作製し、メダカ受精卵に注入した発現解析用トランスジェニックメダカも作製する。
b.シアリダーゼトランスジェニックメダカの解析…シアリダーゼトランスジェニックメダカを観察し、形態や行動、発生などの変化を観察する。組織の評価は切片を作製し、HE染色を行う。また、各組織における糖鎖の変化を評価するために、薄層クロマトグラフィーやレクチンブロット解析を行う。シアリダーゼのプロモーター領域を遺伝子導入したトランスジェニックメダカにおいては、卵における発生段階、および成魚におけるストレス負荷試験などによるGFP発現誘導を評価し、シアリダーゼの機能解析を試みる。
c.シアリダーゼノックダウンメダカの作製および解析…メダカにシアリダーゼを標的とするモルフォリノをインジェクションし、発生の変化を観察することで、シアリダーゼの機能解析を行う。得られた結果は、シアリダーゼトランスジェニックメダカで見られたフェノタイプと併せて考察し、シアリダーゼの生理機能の評価を行う。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
次年度の研究費（直接経費）は、50万円以上の設備備品購入の予定は無く、40万円を実験器具、試薬類などの消耗品、10万円を研究成果を学会発表するための旅費として計画している。
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[Journal Article] Molecular cloning and biochemical characterization of two novel Neu3 sialidases, neu3a and neu3b, from medaka (Oryzias latipes).2013
Author(s)
Shiozaki, K., Takeshita, K., Ikeda, M., Ikeda, A., Harasaki, Y., Komatsu, M., Yamada, S., Yamaguchi, K., Miyaagi, T.,
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Journal Title
Biochimie
Volume: 95
Pages: 280-289
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Susceptibility to colitis-associated colon carcinogenesis in mice lacking plasma membrane-associated sialidase.2012
Author(s)
Yamaguchi, K., Shiozaki, K., Moriya, S., Koseki K., Wada T., Tateno, H., Sato, I., Asano, M., Iwakura, Y., Miyagi, T.,
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Journal Title
PLos One
Volume: 7
Pages: e41132
DOI
Peer Reviewed
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