2013 Fiscal Year Research-status Report
蛍光タンパク質プローブを用いた尿酸輸送評価法の開発
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24790051
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| Research Institution | Tokyo University of Pharmacy and Life Science |
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Principal Investigator |
中村 真希子 東京薬科大学, 薬学部, 助教 (80447557)
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| Keywords | 尿酸 / トランスポーター / ウリカーゼ / 蛍光 |
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| Research Abstract |
1．Uricase-HyPer融合タンパク質による尿酸の蛍光検出
上記のB-1で活性を確認した融合タンパク質に尿酸を添加し、蛍光プレートリーダーによって蛍光値を定量することによって、尿酸量に応じた蛍光値の変化を示すかどうか検討した。反応条件はuricaseとHyPerを混合した測定系での先行研究によって決定したものを用いた。これまで設計した8種のバリアントの中から最も高活性を示した融合タンパク質を以下の実験に用いた。
2．尿酸トランスポーター恒常発現細胞株の作製
研究代表者は既にヒト胎児腎臓由来のHEK293細胞に尿酸トランスポーターhuman URAT1遺伝子を一過性発現し、その発現を抗URAT1抗体を用いた免疫染色により確認した。ここではさらに抗生物質G418による培養を行い、URAT1を恒常発現するHEK293細胞株を作製した。そして14C標識した尿酸の取り込み量を放射定量し、発現したURAT1が尿酸取り込み能を維持しているかどうか評価した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成24年度の研究が当初の計画以上に進展し、融合タンパク質の活性確認を順調に終了させることができていたため、本年度の計画においても、活性の高いタンパク質を用いて検討することができた。また、恒常発現株の作成においては、既に作製法が確立されていたため、こちらも順調に作製を終えることができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
1．尿酸トランスポーター発現細胞へのUricase-HyPer融合タンパク質遺伝子導入
融合タンパク質の遺伝子配列を哺乳類細胞発現用ベクターpcDNA3.1にサブクローニングし、尿酸トランスポーター発現細胞に遺伝子導入する。HyPerタンパク質の蛍光およびURAT1 mRNA発現量定量により、発現の確認を行う。融合タンパク質の発現が見られない場合の対応：①細胞種を他の腎由来培養細胞に変更する。②遺伝子導入条件を変更する（発現ベクターの種類または遺伝子導入法の変更。
2. Uricase-HyPer融合タンパク質発現細胞における尿酸の蛍光検出
融合タンパク質を発現する尿酸トランスポーター発現細胞に尿酸を添加した際の蛍光の経時的変化を蛍光プレートリーダーによりモニタリングする。尿酸輸送能のないトランスポーター変異体を発現する細胞における融合タンパク質の蛍光変化を比較対象とする。
尿酸の蛍光検出が得られない場合の対応：反応条件の再検討（溶液組成、温度、時間）を行う。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
旅費として使用する予定であったが、当初の見込みより多くの金額が必要となったため、余剰分は次年度へ繰り越し、次年度の出張旅費として合算して使用することとした。
最終年度ということで研究発表のための学会出張旅費が必要となる。今年度の余剰分を次年度の予算と合算して使用することとする。
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