2012 Fiscal Year Research-status Report
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24790124
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| Research Institution | Kumamoto Health Science University |
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Principal Investigator |
安楽 健作 熊本保健科学大学, 保健科学部, 講師 (80389543)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2014-03-31
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| Keywords | HIV-1 / Pr55Gag / リン脂質 / PI(4,5)P2 / イノシトールリン酸 / BIACORE |
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| Research Abstract |
HIV-1のもつタンパク質Pr55Gagは細胞膜リン脂質であるホスファチジルイノシトール4,5-2リン酸｛PI(4,5)P2｝を介して宿主の細胞膜に結合することによりHIV-1ウイルス粒子を形成する。この結合を阻害する化合物を開発することが本研究の目的である。
これまでのPr55GagとPI(4,5)P2との結合解析結果から、PI(4,5)P2の2’-アシルだけがPr55Gagとの結合に関与すること、一方でジアシルグリセロール部位をもたないイノシトール3リン酸は結合しないが、高度にリン酸化されたイノシトール6リン酸になるとPr55Gagに強く結合することが示唆されている。
研究初年度として、1’-アシル基をもたず2’-アシル基に相当する部分のみを持ち、またPI(4,5)P2よりリン酸基の数が多いPI(2,3,4,5,6)5リン酸アナログを目的化合物として合成した。また2’-アシル基がPr55Gagとの結合に果たす役割を確認するために、1’-アシル基をもつジアシル型の化合物も同様に合成した。さらにアシル基ではなくエーテル結合でグリセロールと結合させたPI(2,3,4,5,6)5リン酸アルキルアナログにおいても合成した。
合成したアナログを用いて、Pr55Gagの細胞膜結合部位であるMA蛋白質との結合活性をBIACOREにて評価ししたところ、すべてのアナログにおいて同じ炭素鎖を持つDi-C8-PI(4,5)P2よりも強くMA蛋白質に結合した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、はじめにPIリン酸アナログの合成を行い、次にBIACOREを用いてPIリン酸アナログとPr55Gagとの結合活性を評価する。またPIアナログ導入後のGFP融合型Pr55Gagの膜移行を確認し、最終的にHIV-1放出抑制実験を計画している。
PIリン酸アナログの合成は、ミオイノシトールを原料として6つの保護基の脱着を繰り返すことでイノシトール部位を合成し、最終的にアシル部位の導入を行う戦略を用いた。保護基としてアセタール化を経由した手法を採用し、さらに大野・長嶋モノアルキル化反応を用いて選択的な保護基の導入を行うことで、効率的にイノシトール部位を得ることができた。このイノシトール部位を用いて、アシル部位とアミダイトリン酸化法を用いてカップリング反応を行い、最終的な脱保護を行うことで目的物を得ることができた。
生物活性評価においては、以前に合成したビオチン化イノシトール4リン酸をBIACOREのセンサーチップに固定化し、競合実験法を用いてPIリン酸アナログとMA蛋白質との平衡解離定数を算出することができた。
したがっておおむね順調に進展しているものと考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在イノシトール部位においてはラセミ体を用いているため、今後は光学活性体の合成を行い、合成した光学活性体を用いて同様にBIACOREを用いた結合活性を確認する。
BIACOREを使用してリポソーム固定化センサーチップを作製し、細胞膜リン脂質を再現した系を構築する。そのうえで、MA蛋白質との結合解析を実施する。
次にGFP融合型Pr55Gag膜移行実験及びHIV-1増殖阻害実験を行う。
これらの結果をMOEの計算結果と統合し構造最適化を行う。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
光学活性なイノシトール部位を得るために、酵素的アプローチによるミオイノシトール誘導体の不斉非対称化を計画している。それらに基づくHPLCのカラムの購入を予定している。
BIACOREのセンサーチップ上で細胞膜を再現するための試薬ならびにセンサーチップの購入を予定している。
HIV-1増殖阻害実験を行うためのELISAキットをはじめとして生物活性評価における試薬や器具の購入を予定している。
PI(2,3,4,5,6)5リン酸アナログの合成及び結合解析についての論文投稿代ならびに学会発表と情報収集のための旅費の使用を予定している。
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