エピゲノム情報のプロファイリングによる種子エピジェネティクスの分子基盤の確立

2012 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 24790137
• Research Institution: National Institute of Health Sciences
• Principal Investigator: 中村 公亮 国立医薬品食品衛生研究所, 代謝生化学部, 主任研究官 (60570926)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2014-03-31
• Keywords: 種子 / 遺伝子導入 / ゲノム / エピジェネティクス

Research Abstract

初年度は、植物体への異種遺伝子導入は、イネ種子（玄米）のゲノムに野生株とは異なるメチル化をもたらしていることを見出した。近年、GM技術が新たな育種手法として認知されるようになったが、作物管理の不手際やコンプライアンスの欠如は、遺伝子情報の付帯しない未承認GM作物の市場での氾濫をもたらすに至る可能性がある。我が国では、安全性未審査のGM作物の流通は食品衛生法により認められていない。現在、安全性審査済みのGM作物の検出については、定性PCR法やリアルタイムPCR法（「GM食品の安全性について2011」、厚労省医薬食品局食品安全部）が確立しているが、未承認GM作物については、標的とすべきコンストラクト構造が不確定であることから、未だ手探りの状態が続いているのが現状である。そのような中で、玄米の野生種子とGM種子を調べたところ、ゲノムのメチル化パターンがまったく異なっていることを発見した。種子一粒毎についてそのゲノムDNAのメチル化パターンとヒストン修飾パターンを分析し、それらのデータを統合して多変量解析（PCS解析)し、エピゲノム情報としてのプロファイリングを行い、種子エピジェネティクスの分子基盤の確立を行った。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

乾燥状態の種子のゲノムDNA試料は、イネ由来actin 1プロモーター制御下でGFPを発現させるコンストラクト構造を持つpSTARA R-4-sGFP及びpSTARA R-5-sGFPプラスミドを導入したGMと非GM日本晴イネの玄米から調整した。GMと非GM種子は、すでにGFPを発現・非発現が確認された株より収穫されたものを使用したため、容易に実験を開始することが可能であった。actin 1プロモーターは、日本晴ゲノム解析より得られた配列を基にDNAメチル化修飾パターンをバイサルファイト法を用いて内在型と導入型で比較することができた。また、同様にイネとは別のシロイヌナズナ由来ALSプロモーターを有するpSTARA A-2-sGFPを導入したGM玄米のALSプロモーター及びactin 1プロモーターを解析することが可能であった。内在型配列は、公開されているゲノムDNA配列を、また、GMイネに導入されたコンストラクト配列は、インプランタイノベーションズ(株)から提供されたものを参照し解析を遂行することができた。DNAメチレーション部位の特定は、MSAP法とバイサルファイト処理を行ったDNAをシーケンス解析するBSS法を使用することで広範囲の解析が可能であった。得られたメチル化配列は、次のリアルタイムPCR用のメチル化及び非メチル化特異的プライマーの設計に供し、リアルタイムPCRを繰り返し、多変量解析に必要なデータを収集することが可能であった。また、ヒストン修飾のプロファイリングは、化学修飾特異的かつヒストンバリアント特異的な抗ヒストン抗体を用いたクロマチン免疫沈降法（ChIP法）を用いて解析可能であり、予想通り、一連の工程で得られるCt値とEnd-point値をPCS解析に付し、エピゲノム情報のプロファイリングを行うことができた。

Strategy for Future Research Activity

初年度において確立したゲノムDNAメチル化及びヒストンアセチル化に関するデータをPCS解析に付し、種子エピゲノム情報のプロファイリングを行う方法を次年度の発芽前後における環境刺激が修飾バラエティーに及ぼす影響に関する解析に応用する。すなわち、野生玄米及びGM玄米を発芽させる際に、種子を浸漬する溶液の薬剤（スターナ）濃度に加えて、温度（0～40℃）、pH（pH1～5）、溶存酸素濃度（50～80％）及び紫外線強度（UV-A,UV-B, UV-C）のバリエーションを設定し、発芽前後における供試種子の種子間でのゲノムDNAのメチル化の領域特異性及びヒストンの化学修飾のバラエティーについて調べ、必要に応じてPCSプログラムを用いて、多変量解析を行う。並行して、供試試料からゲノムDNAを抽出し、ヌクレオチド組成について調べる。組成分析はLC/MS/MS装置（Thermo社製TSQ Quantum Ultra）を用いて行う。この項目の研究を遂行することによって、野生玄米及びGM玄米を、簡易迅速に峻別する視点を切り開く。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

種子の発芽前後における環境刺激に関して、条件検討を行うため実験環境の整備を行う。ゲノムDNAのメチル化及びヒストンアセチル化のデータを収集するためのMSAP法及びBSS法試薬、リアルタイムPCR試薬、ChIP法に使用する抗体、LC/MS/MS装置に使用するカラムの購入を中心とした消耗品を補充する。また、MeDIPを使用してメチル化DNAを回収し、次世代シーケンサーを使用した解析を計画しており、必要な経費を支出する予定である。

Research Products

• [Journal Article] Application of a qualitative and quantitative real-time polymerase chain reaction method for detecting genetically modified papaya line 55-1 in papaya products (2013)
  • Author(s): Nakamura, K., Akiyama, H., Takahashi, Y., Kobayashi, T., Noguchi, A., Ohmori, K., Kasahara, M., Kitta, K., Nakazawa, H., Kondo, K., Teshima, R
  • Journal Title: Food Chemistry Volume: 136 Pages: 895-901
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A novel DNA extraction and purification method using an ion-exchange resin type kit for the detection of genetically modified papaya in processed papaya products (2013)
  • Author(s): Ohmori, K., Nakamura, K., Kasahara, M., Takabatake, R., Kitta, K., Fujimaki, T., Kondo, K., Teshima, R., Akiyama, H
  • Journal Title: Food Control Volume: 32 Pages: 728-735
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Interlaboratory validation study of an event-specific real-time polymerase chain reaction detection method for genetically modified 55-1 papaya (2013)
  • Author(s): Noguchi, A., Nakamura, K., Sakata, K., Kobayashi, T., Akiyama, H., Kondo, K., Ohmori, K., Kasahara, M., Takabatake, R., Kitta, K., Teshima, R.
  • Journal Title: Journal of AOAC International Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Functional expression of amyloidogenic human stefins A and B in Pichia pastoris using codon optimization (2013)
  • Author(s): Nakamura, K., Maeda,Y., Morimoto, K., Katayama, S., Kondo, K., Nakamura, S.
  • Journal Title: Biotechnology and Applied Biochemistry Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Proficiency testing of unauthorized genetically modified rice using plasmid DNA test samples (2012)
  • Author(s): Kasama, K., Inoue, Y, Akiyama, H., Suzuki, T., Sakata, K., Nakamura, K., Ohshima, Y., Kojima, K., Kondo, K., Teshima, R
  • Journal Title: Japanese Journal of Food Chemistry and Safety Volume: 19 Pages: 215-222
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Quantification and identification of genetically modified maize events in non-identity preserved maize samples in 2009 using an individual kernel detection system (2012)
  • Author(s): Akiyama, H., Minegishi, Y., Makiyama, D., Mano, J., Sakata, K., Nakamura, K., Noguchi, A., Takabatake, R., Futo, S., Kondo, K., Kitta, K., Kato, Y., Teshima, R.
  • Journal Title: Food Hygiene and Safety Science Volume: 53 Pages: 157-165
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Single-laboratory validation of comprehensive GMO detection method using real-time PCR array (2012)
  • Author(s): Mano J., Harada, M., Hatano, S., Futo, S., Minegishi, Y., Noritake, H., Iizuka, T., Nakamura, K., Akiyama, H., Teshima, R., Takabatake, R., Furui, S., Kitta, K.
  • Journal Title: Journal of AOAC International Volume: 95 Pages: 508-516
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Novel anti-HIV-1 activity produced by conjugating unsulfated dextran with polyL-lysine (2012)
  • Author(s): Nakamura, K., Ohtsuki, T., Mori, H., Hoshino, H., Hoque, A., Oue, A., Kanou, F., Sakagami, H., Tanamoto, K., Ushijima, H., Kawasaki, N., Akiyama, H., Ogawa, H.
  • Journal Title: Antiviral Research Volume: 94 Pages: 89-97
  • Peer Reviewed
• [Presentation] PCR-RFLP法を用いたクサウラベニタケの迅速同定法 (2013)
  • Author(s): 近藤一成、小櫃冴未、小林友子、中村公亮、坂田こずえ、野口秋雄、手島玲子
  • Organizer: 日本薬学会 第133年会
  • Place of Presentation: 横浜
  • Year and Date: 20130327-20130330
• [Presentation] ヒトエリスロポエチン遺伝子を導入された組換えニワトリに由来する肉の検知法について (2013)
  • Author(s): 中島治、中村公亮、近藤一成、穐山浩、手島玲子
  • Organizer: 日本薬学会 第133年会
  • Place of Presentation: 横浜
  • Year and Date: 20130327-20130330
• [Presentation] リンゴプロシアニジン(ACT)の経口摂取によるコラーゲン誘導性関節炎の発症遅延効果 (2013)
  • Author(s): 中村公亮、穐山浩、松岡英樹、中島翔平、神田智正、近藤一成、手島玲子
  • Organizer: 日本薬学会 第133年会
  • Place of Presentation: 横浜
  • Year and Date: 20130327-20130330
• [Presentation] Amyloidogenicities of artificially synthesized human stefins A and B (2012)
  • Author(s): Morimoto, K., Katayama, S., Fukumoto, T., Nakamura, K., Nakamura, S.
  • Organizer: 2012 ISNFF-Functional Foods, Nutraceuticals, Natural Health Products and Dietary Supplements
  • Place of Presentation: Hawaii, USA
  • Year and Date: 20121202-20121206
• [Presentation] Evaluation of real-time PCR detection methods for detecting genetically modified Bt rice lines harboring CpTI-KDEL-T-nos transgenic construct in rice product (2012)
  • Author(s): Nakamura, K., Akiyama, H., Kawano, N., Kobayashi, T., Yoshimatsu, K., Mano, J., Kitta, K., Noguchi, A., Kondo, K., Teshima, R.
  • Organizer: 2012 ISNFF-Functional Foods, Nutraceuticals, Natural Health Products and Dietary Supplements
  • Place of Presentation: Hawaii, USA
  • Year and Date: 20121202-20121206
• [Presentation] Apple procyanidins inhibit development of collagen-induced arthritis via down-regulation of Th17 response (2012)
  • Author(s): Nakamura, K., Matsuoka, H., Nakashima, S., Kanda, T., Kondo, K., Teshima, R., Akiyama, H.
  • Organizer: 2012 ISNFF-Functional Foods, Nutraceuticals, Natural Health Products and Dietary Supplements
  • Place of Presentation: Hawaii, USA
  • Year and Date: 20121202-20121206
• [Presentation] フロクマリン類の in vitro 光毒性について (2012)
  • Author(s): 近藤一成、坂田こずえ、小櫃冴未、中村公亮、野口秋雄、手島玲子
  • Organizer: 第４９回全国衛生化学技術協議会年会
  • Place of Presentation: 香川
  • Year and Date: 20121121-20121122
• [Presentation] 遺伝子組換えパパイヤ55-1系統特異的検知法の妥当性評価 (2012)
  • Author(s): 野口秋雄、中村公亮、坂田こずえ、小林友子、大森清美、笠原正輝、高畠令王奈、橘田和美、穐山浩、近藤一成、手島玲子
  • Organizer: 第４９回全国衛生化学技術協議会年会
  • Place of Presentation: 香川
  • Year and Date: 20121121-20121122
• [Presentation] パパイヤ加工品の遺伝子組換えパパイヤ含有に関する総合的評価法 (2012)
  • Author(s): 中村公亮、穐山浩、野口秋雄、小林友子、坂田こずえ、近藤一成、大森清美、笠原正輝、高畠令王奈、橘田和美、手島玲子
  • Organizer: 第４９回全国衛生化学技術協議会年会
  • Place of Presentation: 香川
  • Year and Date: 20121121-20121122
• [Presentation] Applicability of qualitative and quantitative real-time polymerase chain reaction method for detecting genetically modified papaya line 55-1 to papaya products (2012)
  • Author(s): Nakamura, K., Akiyama, H., Kobayashi, T., Noguchi, A., Ohmori, K., Kasahara, M., Kitta, K., Kondo, K., Teshima, R.
  • Organizer: 126th AOAC Annual Meeting & Exposition
  • Place of Presentation: Las Vegas, USA
  • Year and Date: 20120930-20121003
• [Presentation] フロクマリン類のin vitro光毒性について (2012)
  • Author(s): 坂田こずえ、近藤一成、小櫃冴未、中村公亮、野口秋雄、手島玲子
  • Organizer: 第104回日本食品衛生学会学術講演会
  • Place of Presentation: 岡山
  • Year and Date: 20120920-20120922
• [Presentation] クサウラベニタケおよび近縁種のrDNA ITS領域の解析 (2012)
  • Author(s): 近藤一成、小林友子、中村公亮、小櫃冴未、野口秋雄、長沢栄史、手島玲子
  • Organizer: 第104回日本食品衛生学会学術講演会
  • Place of Presentation: 岡山
  • Year and Date: 20120920-20120922
• [Presentation] クサウラベニタケおよび近縁種のPCR-RFLP法を用いた迅速同定法の検討 (2012)
  • Author(s): 小櫃冴未、近藤一成、中村公亮、小林友子、野口秋雄、坂田こずえ、手島玲子
  • Organizer: 第104回日本食品衛生学会学術講演会
  • Place of Presentation: 岡山
  • Year and Date: 20120920-20120922
• [Presentation] タック品種混入粉末試料における遺伝子組換えトウモロコシの定量法開発（第二報） (2012)
  • Author(s): 野口秋雄、穐山浩、中村公亮、坂田こずえ、真野潤一、高畠令王奈、峯岸恭孝、布藤聡、橘田和美、近藤一成、手島玲子
  • Organizer: 第104回日本食品衛生学会学術講演会
  • Place of Presentation: 岡山
  • Year and Date: 20120920-20120922
• [Presentation] 遺伝子組換えコメ検知法に用いる内在性遺伝子の比較検討 (2012)
  • Author(s): 小林友子、中村公亮、近藤一成、野口秋雄、小櫃冴未、峰岸恭孝、真野潤一、高畠令王奈、橘田和美、手島玲子
  • Organizer: 第104回日本食品衛生学会学術講演会
  • Place of Presentation: 岡山
  • Year and Date: 20120900
• [Presentation] 遺伝子組換え表示対象のジャガイモ加工食品から抽出されるジャガイモDNAの断片長について (2012)
  • Author(s): 中村公亮、南竹優美、近藤一成、野口秋雄、小櫃冴未、真野潤一、高畠令王奈、橘田和美、穐山浩、川上浩、手島玲子
  • Organizer: 第104回日本食品衛生学会学術講演会
  • Place of Presentation: 岡山
  • Year and Date: 20120900
• [Presentation] 遺伝子組換えトウモロコシグループテスティング法におけるグループ作成法及び系統判別試験法の確立 (2012)
  • Author(s): 真野潤一、高島かおり、峯岸恭孝、二宮健二、布藤聡、野口秋雄、中村公亮、近藤一成、穐山浩、手島玲子、高畠令王奈、橘田和美
  • Organizer: 第104回日本食品衛生学会学術講演会
  • Place of Presentation: 岡山
  • Year and Date: 20120900
• [Presentation] プロリンリッチプロテイン遺伝子を標的としたコムギ内在性遺伝子検出系の開発とリアルタイムPCRアレイ法への適用 (2012)
  • Author(s): 西辻泰之、菊池洋介、真野潤一、福留真一、遠藤繁、林田拓也、川上裕之、栗本洋一、野口秋雄、中村公亮、近藤一成、穐山浩、手島玲子、高畠令王奈、橘田和美
  • Organizer: 第104回日本食品衛生学会学術講演会
  • Place of Presentation: 岡山
  • Year and Date: 20120900
• [Presentation] 加工品を含む複数のスイートコーン試料からのDNA抽出法の検討 (2012)
  • Author(s): 高畠令王奈、則武寛通、野口秋雄、中村公亮、近藤一成、穐山浩、手島玲子、真野潤一、橘田和美
  • Organizer: 日本食品化学学会 第１8回 総会・学術大会
  • Place of Presentation: 函館
  • Year and Date: 20120621-20120622
• [Presentation] 日欧で検出された安全性未審査遺伝子組換えコメ(Kefeng系統)混入に関する検知技術の開発について（第2報） (2012)
  • Author(s): 中村公亮、穐山浩、河野徳昭、吉松嘉代、野口秋雄、近藤一成、真野潤一、橘田和美、手島玲子
  • Organizer: 日本食品化学学会 第１8回 総会・学術大会
  • Place of Presentation: 函館
  • Year and Date: 20120621-20120622