2012 Fiscal Year Research-status Report
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24790197
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
仁木 大輔 熊本大学, 生命資源研究・支援センター 疾患モデル分野, 研究員 (10621914)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2014-03-31
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| Keywords | 肝芽細胞 / 肝類洞内皮細胞 |
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| Research Abstract |
本研究の目的は、肝類洞内皮細胞の発生機序を解明することである。肝類洞内皮細胞は肝臓固有の内皮細胞であり、肝臓の発生と再生、免疫反応、肝内血流の調節など生命に必須の役割をになっている。しかしながら、その発生機序についてはほとんど未解明のままである。申請者は、過去の肝類洞内皮細胞による知見から「肝細胞の前駆細胞である肝芽細胞が肝類洞内皮細胞の発生に関与している」という仮説を立てた。本研究では、①肝芽細胞欠損マウスによる肝類洞内皮細胞発生状況のin vivo解析、②肝芽細胞と内皮細胞または中胚葉組織の共培養解析による肝類洞内皮細胞への分化誘導実験、によりこの仮説検証を行う。
①肝芽細胞欠損マウスとして、Hhex欠損マウスの作出を試みている。すでにHhex欠損マウスについての報告がされておりこのマウスが肝芽細胞を完全に消失することが示されている。本研究ではMartinez Barbera JPらの報告を参考にHhex欠損マウスの作出を行った(Development, 2000)。Hhexのターゲティングベクターを作製しC57BL/6Nマウス由来のES細胞にエレクトロポレーション法により導入した。168クローンのHhexターゲティングベクターを導入したES細胞を樹立し、現在サザンブロッティング法により、相同組換えされているESクローンの同定を行っている。
②肝芽細胞と内皮細胞または中胚葉組織の共培養解析については予備実験の段階である。マウス胚からの肝芽細胞の単離方法についての検討、共培養に用いる中胚葉系の組織とES細胞からFlk-1陽性細胞への分化誘導方法とその単離方法についての検討を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
研究の進捗状況はやや遅れていると思われる。当初は肝芽細胞欠損マウスとして、肝細胞特異的プロモーターであるAlbumin promoterの下流にDT-Aを接続したコンストラクトが導入されているマウスの作出を試みていた。しかしながら、その作出が困難であったためHhex欠損マウスへと変更している。このマウス作出計画の変更が進捗の遅れの主な理由である。その後のHhexのターゲティングベクターの作製、ES細胞の樹立までにおいては、特に問題の発生はない。肝芽細胞と中胚葉系組織、細胞との共培養実験については進捗に問題ないと思われる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究の推進方策として、
①肝芽細胞欠損マウスによる肝類洞内皮細胞発生状況のin vivo解析としては、相同組み換えされているES細胞の同定後、Hhexヘテロ欠損マウスの作出を行う。Hhexヘテロ欠損マウス同士をかけ合わせてHhexホモ欠損マウスを作出し、肝類洞内皮細胞のマーカーである、Stabilin2、limphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1(Lyve1)などの抗体を用いた免疫染色、または肝類洞内皮細胞マーカーのRNAプローブを用いたin situ hybridizationにより肝芽細胞が欠損している状態での肝類洞内皮細胞の分化状態を解析する。
②肝芽細胞と内皮細胞または中胚葉組織の共培養解析による分化誘導実験としては、マウス胚から単離した肝芽細胞と、ES細胞からFlk-1陽性細胞へと分化誘導した細胞の共培養を行い、肝類洞内皮細胞マーカーであるStabilin2、Lyve1の発現量をRT-PCRまたは免疫染色により解析する。加えて、様々なシグナルの阻害剤を培地に添加させることにより、肝類洞内皮細胞への分化に必要とされるシグナルの同定を行う。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
本年度は46円が使用不可能な金額として残ったため、次年度に持ち越しを申請している。次年度の研究費の使用計画としては、実験動物購入・飼育費として約400000円、分子生物学実験試薬費として約200000円、分子生物学実験器具費として約100000円、組織化学実験試薬費として約300000円、組織化学実験器具費として約200000円、培養関係試薬費として約600000円、培養関係器具費として約100000円、論文投稿費として約200000円の使用を予定している。
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