2013 Fiscal Year Research-status Report
腎集合管水輸送におけるＶ１ａＲシグナル伝達分子の同定
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24790222
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| Research Institution | Kitasato University |
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Principal Investigator |
安岡 有紀子 北里大学, 医学部, 助教 (50348504)
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| Keywords | V1aR / V2R / AQP2 / アシドーシス |
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| Research Abstract |
本年度は、アシドーシス時にAQP2の管腔膜移行が阻害される機構におけるV1aRシグナルの関与を調べるために、実験的に代謝性アシドーシスを誘発し、水電解調節分子の発現変化をV1aR KOとWTで比較した。
代謝性アシドーシスは、KO、WTマウスに2.5% NH4Cl食を6日間負荷することにより誘導し、血液・尿成分を比較し、AQP2はwestern blotting法により発現量を定量し、免疫染色法により細胞内局在を調べ、V1aR、V2Rは高感度in situ hybridization法により発現量を解析した。
アシドーシス誘発時におけるWTのV1aR mRNAの発現量は、MTALとOMCD(IC-A)においてのみ、有意に増加した(P < 0.05)。血漿[AVP](pg/ml)は、アシドーシス誘導によりWT、KO共に増加せず有意差はなかった（WT: 304.4±58.5 (0 d), 293.6±52.9 (6 d)、KO: 443.6±46.5 (0 d), 479.6±41 (6 d)）。尿中AVP排泄量(pg/d)も同様の傾向を示した（WT: 417.2±51.9 (0 d), 531.6±84.2 (6 d)、KO: 645.3±117.7 (0 d), 970.1±252.8 (6 d)）。アシドーシス誘導時、WTのAQP2、V2R発現量は増加したが、AQP2は細胞質内に限局した。KOマウスでは、AQP2、V2Rの発現量が著しく低下し、AQP2は管腔膜に局在した。
AVP-V1aR (IC)を介したシグナルは、V2R (PC)の発現/活性化とAQP2の管腔膜から細胞質への移行に影響し、代謝性アシドーシス時の尿濃縮能低下をもたらすと考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成25年度は、1. アシドーシス時にV1aRの発現量が変化する細胞の同定、2. V1aR KOの水電解質調節分子の解析、3. アシドーシス時のV1aR KOの血漿、尿成分、水電解質調節関連分子の解析を計画した。
1. アシドーシス時にV1aRの発現量が変化する細胞の同定：アシドーシスを誘導する条件は、0.28M NH4Cl / 2% sucroseをマウスに飲水させる方法が最も多く使われている方法であるが、アシドーシスを誘導すると同時に血漿浸透圧を上昇させ血漿AVP濃度の上昇も引き起こす。血漿AVP濃度を上昇させないでアシドーシスを誘導させるため、NH4Clを飲水させるのではなく、餌に混ぜることにより(2.5% NH4Cl)、条件を確立した。アシドーシス誘導後、WTマウスの腎V1aR mRNA発現量を尿細管の部位別、細胞別にISH法により定量し、髄質部TALとOMCDの間在細胞typeAで増加していることを明らかにした。（達成度100%）
2. V1aR KOの水電解質調節分子の解析：アシドーシス誘導時の水電解質調節分子AQP2、V2Rを解析した。AQP2, V2R発現量は、KOにおいて有意に低下していたが、AQP2の管腔膜移行はWTよりも多いことを明らかにした。（達成度100%）
3. アシドーシス時のV1aR KOの血漿、尿成分、水電解質調節関連分子の解析：WTとKOのアシドーシス誘導時の血漿pH、HCO3-、pCO2、電解質濃度、AVP濃度を調べ、比較した。プロスタグランジン量の比較、AQP2の発現量を制御すると考えられているインスリン、TNFα、CREB、AP-1の発現量の比較は平成26年度に行う予定である。（達成度60%）
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| Strategy for Future Research Activity |
集合管におけるV1aRシグナルの解明するために、V1aR KOマウス、集合管主細胞の培養細胞を用いて解析を行う。
・アシドーシス時・脱水時のV1aR KOの血漿、尿成分の解析：プロスタグランジンおよびAQP2の発現を制御すると考えられているインスリン、TNFα、CREB (cAMP-responsive element binding protein)、AP-1 (activator protein 1)、NF-kBなどの遺伝子、蛋白の発現量を解析する。
・V1aRによるV2R、AQP2の発現調節分子の同定：脱水及び酸負荷後のV1aRによるV2R, AQP2発現調節分子を調べるため、WTとKOの腎蛋白の発現を比較し解析する。
・V1aRによる水透過性に関与する分子の同定：上記の実験によりWTとKOで発現の違いがあった腎蛋白のうち、腎集合管に発現しているものを特定する。腎集合管培養細胞に過剰発現させ、脱水時（VPに添加）、アシドーシス時（細胞外液を酸性化）にAQP2の膜移行が変化するか解析する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
25年度中に発注し納入予定であった物品が遅れたため、支払いが26年度に繰り越しになった。
26年度は余裕を持って物品を発注し、助成金を使用するようにする。
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[Journal Article] Effects of Atrial Natriuretic Peptide on Bicarbonate Transport in Long- and Short-Looped Medullary Thick Ascending Limbs of Rats.2013
Author(s)
Hiroshi Nonoguchi, Yuichiro Izumi, Yushi Nakayama, Takanobu Matsuzaki, Yukiko Yasuoka, Takeaki Inoue, Hideaki Inoue, Tomohiko Mouri, Katsumasa Kawahara, Hideyuki Saito, Kimio Tomita.
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Journal Title
PLOS one
Volume: 8
Pages: e83146
DOI
Peer Reviewed
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[Presentation] Mechanisms of erythropoietin production by aldosterone in the intercalated cells
Author(s)
Yuichiro Izumi, Yukiko Yasuoka, Takanori Nagai, Kahori Hori, Yushi Nakayama, Masayoshi Nanami, Takeshi Nakanishi, Akito Tanoue, Kimio Tomita, Katsumasa Kawahara, Hiroshi Nonoguchi
Organizer
アメリカ腎臓学会
Place of Presentation
アトランタ
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