2012 Fiscal Year Research-status Report
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24790268
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Research Institution | Doshisha Women's College of Liberal Arts |
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Principal Investigator |
天ヶ瀬 葉子 同志社女子大学, 薬学部, 助教 (90550822)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | ゲノム薬理学 / 癌 / 遺伝子 / 診断 / 創薬 |
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| Research Abstract |
現在の癌早期発見の概念よりさらに早い前癌状態での診断を可能にすること、安全な薬剤を開発する上で早期に発癌性の有無を見極められるようにすることを目的として研究を開始した。これまでに発癌性物質を最長２８日間投与されたラットの前癌状態の肝臓で発現が上昇している３つの遺伝子NADE, DR6, Aβを見いだした。発癌過程でのNADE, DR6, Aβの発現変化を追い、これらの発現と発癌との因果関係を明らかにするために、平成２４年度は３項目の実験の実施を計画し、遂行した。
1. 発癌性物質であるジエチルニトロソアミンをラットに長期間投与し、経時的に肝臓組織や血液を採取する実験を開始した。肝臓組織はその後の実験の用途別にそれぞれにあった形状や状態で保存した。
2.発癌性物質を２８日間ラットに投与すると肝臓は前癌状態に到達することが分かっている。そこで２８日間投与によって得られた組織を使い、immunohistochemistry (IHC)とin situ hybridisation (ISH)の実験条件を検討した。前癌状態のラット肝臓組織におけるNADEの発現を購入可能な抗体で免疫染色できた。続いてDR6の免疫染色を購入可能な抗体で行っているが現在までに十分な感度の抗体は得られておらず、ISH法による染色と平行して検討している。
３. NADE, DR6のタンパク質の関わりを確認する為に、一過性強制発現させた培養細胞を用いて免疫沈降法にて簡便に確認する計画で、電気穿孔法で共発現を試みたが死細胞が多く難航した。このため、NADEを定常発現する細胞株を構築し、そこにDR6を一過性強制発現させることにした。これにより、NADE, DR6の両方が発現する細胞を多く作り出すことに成功した。
これらの実験は、発癌過程におけるこれらのタンパク質の細胞内での役割を解明する上で重要である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ラットに発癌性物質であるジエチルニトロソアミンを発癌まで長期投与を行っているが、経時的に採取しているサンプルからは徐々に病変を形成していることが確認できており、動物実験は順調にすすんでいる。これらのサンプルを使って行うアッセイの為の実験条件の検討は、NADEの発現の確認とその細胞種の同定は成功しているものの、DR6のIHCによる確認は十分な感度の抗体が入手できていない。そこでISH法での染色を進めている。NADEとDR6のタンパク質を培養細胞に電気穿孔法で一過性強制発現させる簡便な方法をもちいる予定であったが、これらを同時に強制発現させると多くの細胞が死んでしまう為、その後のアッセイに向かないことが分かった。そこで、翌年度以降に行う予定であったNADEを定常発現させた細胞に、DR6を一過性強制発現させるという方法を行うことにし、すでに成功している。以上のような状況により、おおむね順調に進展しているといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成２４年度に構築した定常発現細胞株を用い、in vitroでのアッセイで３つのタンパク質の関係を精査する。現在検討中のIHCやISHなどのアッセイ系を確立させる。発癌性物質の長期投与により発癌に到達したラットの肝臓組織や血液サンプルなどが全てそろえば、これらのアッセイ系を用いて発癌と３つのタンパク質との関係を明らかにする。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
NADE, DR6, Aβの三者が関わることを確認するための免疫沈降は細胞に一過性強制発現させて、平成２４年度中に行う予定であったが、一過性強制発現ではほとんどの細胞が死んでしまい難航した。そこで、次年度以降に構築する予定であったNADEまたはDR6を定常発現する細胞株を構築し、この実験にも使用することにした。定常発現株を構築するには時間がかかった為、年度内に免疫沈降が行えなかった。次年度に持ち越す研究費は免疫沈降の為の抗体や試薬を購入するためのものであり、定常発現株は構築できているので、すぐに使用する予定である。翌年度以降に請求する研究費は、Aβタンパク質の発現や精製、DR6やNADEを内在的に発現する細胞の探索、アポトーシスアッセイなど、本来の実施計画通りに使用する予定である。
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