2012 Fiscal Year Research-status Report
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24790290
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
西山 敦哉 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (50378840)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2014-03-31
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| Keywords | DNAメチル化 / DNA複製 / Dnmt1 / Uhrf1 / PCNA / ヒストン / クロマチン / ユビキチン |
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| Research Abstract |
DNA複製の過程においてDNAメチル化パターンを維持するために、DNAメチル化酵素1 (Dnmt1)による維持DNAメチル化が重要な役割を果たしている。Dnmt1のメチル化部位へのリクルートは、ヘミメチル化DNAに高い特異性を示すUhrf1を必要とする。これまでDnmt1, Uhrf1の DNAメチル化制御における役割についてはよく理解されてきたが、その活性制御やDNA複製装置形成との相互作用など生化学的理解は未だ十分でない。 本研究はこれまで研究の遅れていた維持DNAメチル化制御機構の生化学的解析をアフリカツメガエル卵由来の無 細胞系を用いて行い、その分子機構を詳細に明らかにすることを目的として行った。
まずDnmt1を抽出液から免疫除去するとUhrf1のクロマチン結合量が大きく上昇し、さらにこれがヒストンH3の翻訳後修飾をもたらすことが分かったので、この制御機構及び機能解析を行った。質量分析による解析の結果、これまでに報告のないヒストンH3のリジン23におけるユビキチン化修飾であることが明らかになった。この修飾はUhrf1を必要とし、またDNA複製依存的に起こる。さらに、ユビキチン化を受けたヒストンH3に特異的に結合する因子を探索したところ、意外なことにDnmt1が同定された。変異体を用いた解析により、このDnmt1とユビキチン化ヒストンの結合は、Dnmt1のReplication foci targeting sequence (RFTS)を介して起こっていることが示された。さらに、Uhrf1のユビキチンリガーゼ活性を欠く変異体はDnmt1のリクルート能を失った。以上の結果は、Uhrf1によるヒストンH3のユビキチン化がDnmt1のリクルートに重要な役割を果たしていることを強く示唆するものである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
今年度の研究により、まずアフリカツメガエル卵抽出液を用いた維持DNAメチル化機構を試験管内で再現できることを示し、その解析についての実験系を確立した。その結果、Uhrf1による新規ヒストン修飾であるH3K23ユビキチン化を発見し、そのDnmt1リクルートにおける役割を明らかにすることができた。これまで、Uhrf1はDnmt1と相互作用することにより、ヘミメチル化部位へのリクルートを行うと考えられていたが、今回の結果は新たなモデルを提唱するに十分なものであると考える。当初の課題であるDNA複製装置との関わりについても、Dnmt1、Uhrf1いずれのリクルートにもDNA複製が必要であることを示すことができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度の解析により、ツメガエル卵抽出液を用いた維持DNAメチル化機構の解析の土台はできたと考えられる。今後は、前年度に得られた知見を元に、培養細胞を用いた実験とともにさらなるUhrf1及びDnmt1の機能解析を進める。また、卵抽出液を用いた実験系を用いて、これまで機能未知であったメチル化制御因子であるユビキチンリガーゼTrim28やクロマチンリモデリング因子LSHの機能解析を開始する。また、メチル化制御因子の機能についてのDNA複製装置の必要性とともに、十分性についても今後の解析により明らかにしたい。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
引き続き研究に使用する消耗品の購入を中心に、Trim28やLSHなど新規因子に対する特異抗体の作製、国内の共同研究者との研究打ち合わせ等に使用する。
また、次年度において一層研究を遂行するため、繰越金を新規抗体作製に充てる予定である。
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