2013 Fiscal Year Research-status Report
糖鎖の動態追跡を目的とする質量同位体測定に基づく高速・高感度糖鎖解析法の確立
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24790301
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
中嶋 和紀 独立行政法人理化学研究所, 脳科学総合研究センター, 研究員 (10442998)
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| Keywords | 糖鎖 / 糖タンパク質 / 質量分析 / 糖ヌクレオチド |
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| Research Abstract |
糖鎖が様々な病態に深くかかわっていることが明らかになりつつあるが、これまで糖鎖の合成、あるいは分解だけに絞ったいわばスナップショット的な研究が多く、動的な解析は殆どなされていない。本研究は、単糖の安定同位体で代謝標識した糖鎖をMS測定する方
法を確立し、糖鎖の合成から分解に至る一連の過程を代謝回転として動的に捉え、病態における糖鎖の新たな役割を明らかにすることが目的である。
本年度は、昨年度までに検討した複合糖質の質量同位体分布解析法により、糖ヌクレオチドがどの糖鎖にどの程度取り込まれたか、その全貌を追跡した。糖鎖の合成過程が少ないハイマンノース型N型糖鎖は、複合型糖鎖に比べて高いラベル効率を示したことから、これらの結果は糖鎖の合成速度を反映することが明らかになった。生合成が細胞質で直接行われる合成過程が特に短いヒアルロン酸は特にラベル効率が高く、ゴルジ体内で修飾される他のプロテオグリカンと比べて高かった。興味深いことにスフィンゴ糖脂質への取り込みは低かった。N型糖鎖の分岐の程度、シアル酸の有無において違いにおいてラベル効率に違いは見られなかった。
コアフコースの有無やシアル酸の結合様式(alpha2-3もしくはalpha2-6)の違いにより糖鎖のラベル効率が異なること見出した。糖転移酵素の影響を調べるため、コアフコース転移酵素(Fut8)欠損マウスの繊維芽細胞から調製した糖鎖の質量同位体を解析したところ違いは認められなかった。逆に糖タンパク質のエンドサイトーシス、いわゆる糖鎖の分解を制御している可能性があるシアル酸認識タンパク質(Siglec9)の過剰発現株も解析した。こちらも同様に違いは認められなかった。今後はコアフコースやシアル酸月糖鎖の動態と機能の発現という観点から、その生物学意義を探索する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究は①糖鎖の質量同位体測定に基づく動態追跡法の確立、②モデル実験の実施、③高感度糖鎖解析法の確立、④疾患における変化の探索、という４つの計画から構成される。平成２５年度は引き続いて、当初の計画どおり計画②と④の基礎的検討を行った。
②モデル実験を行い糖鎖の代謝回転を構造にプロファイルした。糖鎖構造が明らかな肝癌細胞株を用いて、N型糖鎖とO型糖鎖、ハイマンノース型糖鎖と複合型糖鎖、フコースの有無が合成速度に与える影響を検討するとともに、他にグルコサミノグリカンやスフィンゴ糖脂質糖鎖の影響も検討した。
④計画②で見出されたコアフコースの有無やシアル酸の結合様式(alpha2-3もしくはalpha2-6)のラベル効率への影響について、その原因を検討しており、疾患との関わりについて現在も検討を開始しはじめた。
その一方で、質量同位体のデータを簡便に解析するシステムの開発、データベースの整備などは全く手つかずのままであり最終年度の課題として残された。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究は①糖鎖の質量同位体測定に基づく動態追跡法の確立、②モデル実験の実施、③高感度糖鎖解析法の確立、④疾患における変化の探索、という４つの計画から構成される。
来年度はまず糖鎖の高感度解析システムを立ち上げることを優先する。例えば申請者の共同研究者が最近導入した、現時点で最も高感度なLC-MSシステム（QTRAP6500）を使用して、且つ、ナノLC用カラムを用いた高感度解析システムを確立し、極微量糖鎖の
同位体解析を試みる。またボロン酸ケミストリーに基づいた特定の糖タンパク質を濃縮する技術についても、別プロジェクトで進めているので応用する。
最終年度はまた計画④として疾患特異的な代謝回転の変化を見出すため、細胞増殖を制御するTGFβ受容体糖鎖やグルコース輸送体２の糖鎖の代謝回転を追跡する。また現在、研究代表者が所属する研究室で見出されたGPCR受容体(GPRC5B)の糖鎖の生物学的意義を明らかにするため、これらの糖タンパク質糖鎖の構造的変化と代謝回転についても明らかにする。様々な視点から考察するため、様々な分野の研究者と、柔軟性をもって新しい仮説を組み立てて共同研究を進めていく。
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Research Products
(7 results)
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[Journal Article] Mass isotopomer analysis of metabolically labeled nucleotide sugars and N- and O-glycans for tracing nucleotide sugar metabolisms.2013
Author(s)
Nakajima, K., Ito, E., Ohtsubo, K., Shirato, K., Takamiya, R., Kitazume, S., Angata, T., Taniguchi, N.
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Journal Title
Mol. & Cell Proteomics.
Volume: 12
Pages: 2468-2080
Peer Reviewed
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[Journal Article] Metabolically programmed quality control system for dolichol-linked oligosaccharides.2013
Author(s)
Harada, Y., Nakajima, K., Masahara-Negishi, Y., Freeze, H.H., Angata, T., Taniguchi, N., Suzuki, T.
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Journal Title
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A
Volume: 110
Pages: 19366-19371
Peer Reviewed
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[Journal Article] Identification of ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 3 (ENPP3) as a regulator of N-acetylglucosaminyltransferase GnT-IX (GnT-Vb).2013
Author(s)
Korekane, H., Park, J.Y, Matsumoto, A., Nakajima, K., Takamatsu, S., Ohtsubo, K., Miyamoto, Y., Hanashima, S., Kanekiyo, K., Kitazume, S., Yamaguchi, Y., Matsuo, I., Taniguchi, N.
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Journal Title
J. Biol. Chem.
Volume: 288
Pages: 27912-27926
Peer Reviewed
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[Presentation] Mass isotopomer analysis of metabolically labeled nucleotide sugars and N- and O-glycans for tracing nucleotide sugar metabolisms.2013
Author(s)
Nakajima, K., Ito, E., Ohtsubo, K., Shirato, K., Takamiya, R., Kitazume, S., Angata, T., Taniguchi, N.
Organizer
HUPO 12th Annual World Congress
Place of Presentation
yokohama
Year and Date
20130914-20130918
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