2014 Fiscal Year Annual Research Report
ＴＦＡＭを中心としたミトコンドリアゲノムの分配調節機構の解明
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24790324
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| Research Institution | Jichi Medical University |
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Principal Investigator |
笠嶋 克巳 自治医科大学, 医学部, 講師 (80382844)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | ミトコンドリアDNA / 分配 / TFAM |
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| Outline of Annual Research Achievements |
TFAMの調節因子として単離したClpXとTFAM間の相互作用ドメインを決定する目的で、分割型蛍光タンパク質を用いたin vivoでの相互作用解析を試みた。いずれのタンパク質もN末にミトコンドリア標的配列を持つことから、分割型蛍光タンパク質は各タンパク質のC末に融合させた。しかしながら本解析では相互作用を示す蛍光シグナルが見られなかったため、機能ドメインの決定には至らなかった。一方でTFAMは自己相互作用を介してvitroで多量体を形成する。In vitroケミカルクロスリンク解析より、TFAMはClpXの存在によって多量体がほどかれ、主に二量体を形成することがわかった。よってTFAMの多量体化調節がmtDNAの分配に関わる可能性が示唆された。
TFAM間のvivoにおける相互作用ドメインを決定する目的で、上記分割型蛍光タンパク質を用いた相互作用解析を試みた。その結果ミトコンドリア上で蛍光シグナルが観察され、vivoにおけるTFAM間相互作用が確認された。欠失変異体を用いて同解析を行ったところ、相互作用にはN末側のDNA結合モチーフが重要であることがわかった。この領域は最近海外のグループの構造解析より明らかになったvitroでのTFAM二量体に関わるドメインと同じであり、その報告をもとに二量体不全変異体を作製した。この変異体を細胞に発現させてTFAMノックダウンのレスキュー解析を試みたが、野生型TFAMと比較して発現量が低く、タンパク質分解システムで積極的に分解されていることが示唆された。
変異型mtDNAを一定の割合で含む線虫変異株を海外の線虫ストックセンターから入手し、変異型mtDNA含有率を定量するためのリアルタイムPCRシステムを構築した。
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