ＲＵＮＸ遺伝子の後転写制御は神経芽腫の増殖・分化を決定するか？

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 24790325
• Research Institution: Dokkyo Medical University
• Principal Investigator: 井上 健一 獨協医科大学, 医学部, 講師 (90587974)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: microRNAクローニング / 次世代シーケンサー

Outline of Annual Research Achievements

前年度作成した改良型アプタマーtRSA-RUNX-UTRを神経芽細胞株に遺伝子導入し、予定していたmicroRNAクローニングを試みた。しかしながら、結合したmicroRNAをプライマーとしてcDNAを合成する当初のプロトコルでは、得られた大腸菌クローンに陽性が得られなかった。形質転換の過程で、一定以上のコピー数が必要であることが原因と考えられる。また、RUNX-UTRに細胞死の効果があるため、生細胞の数を確保できないことも、感度低下の原因と推測する。
感度の問題を克服するため、最初にmicroRNAのプロファイルを作成し、そのリストからPCRで増幅して絞り込む方針に転換した。
細胞株のmicroRNAのプロファイリングを目的として、small RNAのシーケンシングを行った。得られたリストのプライマーを作成して、PCRで絞り込みを行った。
いくつかの候補が挙がっているため、最終年度機能解析を行う。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

前年度のトラブルシュートでアプタマーの安定性は改善したが、予想通り結合するmicroRNAをクローニングするには感度が十分ではないことが分かった。
より感度の高いRT-PCR法で同定するため、候補遺伝子のリスト作成のために次世代シーケンサーを使用し、絞り込んだ。
細胞種により異なるリストが得られ、妥当性検証に時間が掛かった。

Strategy for Future Research Activity

候補microRNAとRUNX1/3の関係を機能実験で検証する。
候補microRNAの腫瘍抑制／がん遺伝子の機能を調べる。

Causes of Carryover

年度内試薬類は足りており、少額なので使用しなかった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

microRNAの機能実験を行う。