2012 Fiscal Year Research-status Report

Ｃ型肝炎ウイルス特異的ＣＤ８Ｔ細胞機能不全の網羅的解析

Research Project

Project/Area Number	24790720
Research Category	Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
Research Institution	Keio University
Principal Investigator	石橋由佳慶應義塾大学, 医学部, 助教 (60528305)
Project Period (FY)	2012-04-01 – 2016-03-31
Keywords	C型肝炎 / CD8 T細胞 / exhaustion
Research Abstract	現在までにHCVの持続感染の原因として、制御性T細胞、IL-10産生CD4 T細胞、抑制性補助シグナルであるPD-L/PD-1およびの関与を明らかにしてきた。本年度は、C型慢性肝炎患者の末梢血を用いて以下の検討を行った。①HCV, EBV, CMV, influenza virus特異的CD8 T細胞の同定　HLA A24拘束性class1 tetramerを用いてフローサイトメトリーにより検討したところ、既知の報告どおり末梢血リンパ球中に0.01%から0.7%の頻度でウイルス特異的CD8 T細胞を検出することができた。②C型慢性肝炎患者の末梢血中HCV特異的CD8 T細胞の表現型の検討（細胞表面染色）　末梢血中HCV特異的CD8 T細胞は他のウイルス特異的CD8 T細胞と比較し、有意に高いPD-1, CD160, LAG-3の発現を認めた。一方4-1BB, CTLA-4に関してはほとんど発現を認めなかった。③C型慢性肝炎患者の末梢血中HCV特異的CD8 T細胞のサイトカイン産生能（細胞内サイトカイン染色）　HCV特異的CD8 T細胞はHCV非特異的CD8 T細胞と比較し、有意にTNF-a, IFN-gの産生が乏しかった。一方IL-10に関してはいずれのウイルス特異的CD8 T細胞もほとんど産生を認めなかった。Preliminaryの段階であるが、特にPD-1陽性CD8 T細胞はTh1サイトカインの産生が乏しい傾向にあった。以上の結果より、末梢血中HCV特異的CD8 T細胞は抑制性補助シグナルの高発現、エフェクター機能の低下を認め、持続感染に寄与している可能性が示唆された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本研究は4年間にわたる研究であり、本年度は研究の根幹となる適切な抗体を用いたウイルス特異的CD8 T細胞の同定、およびフローサイトメトリーを含めた手技の確立に努めた。米国においてはHLA A2拘束性テトラマーを用いた研究が多いが日本人においてHLA-A2陽性率は低く、今回日本人の50-60%前後が有するHLA-A24拘束性テトラマーを用いて検討を行った。その結果、ほぼ同様の頻度でHCV特異的CD8 T細胞を検出することができた。また機能解析においても、HCV特異的CD8T細胞はPD-1以外にもCD160, LAG-3など他の抑制性補助シグナルを発現していることを見出し、エフェクター機能の低下を介して持続感染に寄与している可能性が示唆された。次年度以降今回確立した手技、手法を用いてさらに本研究を発展させることができると考えている。
Strategy for Future Research Activity	今後は、第一に抗ウイルス療法中のHCV特異的CD8 T細胞機能の経時的変化と補助シグナル阻害による機能修飾の検討を行っていく。具体的にはGenotype 1b、高ウイルス量の難治例におけるPeg IFNとリバビリン、プロテアーゼ阻害剤による3剤併用療法中の末梢血中HCV特異的CD8 T細胞の割合、エフェクター機能を投与前、1W, 2W, 4W, 8W～48Wまで経時的に検討し、治療効果との相関を明らかにする。可能な限り投与前、投与終了時に肝生検を行い、肝内浸潤HCV特異的CD8 T細胞との比較検討を行う。さらに前年度の検討においてエフェクター機能の改善が認められた抑制性補助シグナルの機能的阻害抗体を用いて経時的にHCV特異的CD8 T細胞の機能修飾をin vitroで検討し、抗ウイルス療法抵抗症例に対する新規免疫療法の確立を目指す。他施設からの報告によると、ウイルス量が多いほどPD-1の発現は亢進しており、逆にPD-L/PD-1シグナル阻害による機能修飾に抵抗性を示す。抗ウイルス療法開始後、ウイルス量の低下に伴い各補助シグナルの発現が低下し、その結果各シグナル阻害抗体に対する反応性も高まることが予想される。将来的に抗ウイルス療法との併用により早期にウイルス量を減らすことが可能となれば、治療効果を高めることができると考えている。さらに、次年度以降に肝細胞癌特異的CD8 T細胞の機能解析を行い、発癌の免疫学機序の解明したいと考えている。
Expenditure Plans for the Next FY Research Funding	次年度もフローサイトメトリーを用いた末梢血リンパ球の検討が主であり、消耗品（モノクローナル抗体、培養液、FBS、FCM消耗品、ELISAキット、RNA抽出キットなど）に充てる予定である。未使用額の発生は効率的な物品調達を行った結果であり、翌年度の消耗費購入に充てる予定である。