2012 Fiscal Year Research-status Report
腎糸球体上皮細胞スリット膜の形成・維持におけるシナプス小胞輸送機構の解明
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24790839
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Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Research Institution | Niigata University |
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Principal Investigator |
福住 好恭 新潟大学, 医歯学系, 助教 (20609242)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | スリット膜 / シナプス小胞 / ポドサイト / ノックアウトマウス / SV2B / CD2AP / ネフリン |
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| Research Abstract |
シナプス小胞輸送分子SV2Bの機能喪失が、ポドサイトのバリアー機能、突起の形態、スリット膜構造、スリット膜機能分子の発現動態等に、どのように影響するかをSV2B遺伝子ノックアウトマウスを用いて解析した。研究代表者が所属する研究室は、SV2A；SV2B遺伝子変異（SV2A+/-；SV2B+/-）マウスの凍結精子をジャクソン研究所から購入した。新潟大学脳研究所附属生命科学リソース研究センターの協力の下、体外受精によりSV2B遺伝子ノックアウト（SV2A+/+；SV2B-/-）マウスを作製し、同マウスを用いた解析を進めた。
SV2Bノックアウトマウスの糸球体のバリアー機能、ポドサイトの形態、スリット膜構造を解析した。代謝ケージを用いて経時的に蓄尿（24時間）し、尿中への蛋白排泄量を算出した。その結果、野生型マウスと比較してノックアウトマウスで有意な蛋白尿の上昇が観察された。経時的に腎材料を摘出し、糸球体の形態、ポドサイト機能分子群の発現を解析し、野生型マウスと比較した。糸球体数、糸球体径は両マウス間に差は無かった。一方、共焦点レーザー顕微鏡を用いた免疫組織学的解析でスリット膜機能分子（Nephrin、Podocin、CD2AP、NEPH1など）の発現を詳細に検討したところ、ノックアウトマウスではCD2APの発現強度が著明に低下し、不連続なパターンで観察された。Nephrin、Podocinについても同様の所見が観察された。片腎摘出手術やアルブミン連日投与による蛋白負荷モデルを作製し、腎負荷時におけるスリット膜構造の変化を解析した。ノックアウトマウスは傷害に対する脆弱性を示すことが観察された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究代表者は、シナプス小胞輸送分子SV2Bの機能喪失が、ポドサイトのバリアー機能、突起の形態、スリット膜構造、スリット膜機能分子の発現動態等に、どのように影響するかを調べるため、SV2B遺伝子ノックアウトマウスを用いて解析した。まず、SV2B遺伝子変異マウスの凍結精子をジャクソン研究所から購入し、体外受精によるSV2B遺伝子ノックアウトマウスの作製に成功した。ゲノムDNAからのPCRによりSV2Bノックアウトマウスの遺伝子型を決定し、SV2B mRNA発現をRT-PCR、SV2B蛋白質発現をウエスタンブロット法でそれぞれ解析し、得られたSV2BノックアウトマウスのSV2B発現の消失を確認した。
次に、ノックアウトマウスのポドサイトにおけるバリアー機能、及びスリット膜構造の異常を解析するために、代謝ケージを用いた尿中への蛋白排泄量（24時間）を算出した。その結果、野生型マウスと比較してノックアウトマウスで有意な蛋白尿の上昇を観察した。また、ノックアウトマウスから腎を摘出し、光学顕微鏡下における糸球体構造の解析や、スリット膜の微細な構造異常の有無を電子顕微鏡を用いて解析した。さらに、SV2Bノックアウトマウスにおけるスリット膜機能分子の発現動態を解析し、ノックアウトマウスにおいてスリット膜機能分子CD2APの発現異常を発見した。また、片腎摘出したノックアウトマウスの生存率は野生型マウスと比較して低く（100% vs 50%）、BSA連日投与により蛋白負荷モデルでは、BSA負荷1日目の蛋白尿が、SV2B KOマウスでは野生型マウスに比較して顕著であった。
初年度の目的であったSV2Bノックアウトマウスの作製に成功した。また、研究計画通りにノックアウトマウス解析を進めることができており、研究はおおむね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
腎発生時のスリット膜形成機構におけるシナプス小胞輸送分子SV2Bの役割を、SV2B遺伝子ノックアウトマウスの胎生期の腎を用いて解析する。具体的には、出生日に産仔を得て、腎を摘出する。摘出した腎組織についてHE染色及びPAS染色を行い、光学顕微鏡下で腎の異常の有無を調べる。また摘出した腎からRNAと蛋白質を抽出し、腎発生に必須な遺伝子マーカー（WT1、Pax2、Sall1など）、及びスリット膜機能分子の遺伝子発現をリアルタイムPCRとウエスタンブロット法を用いて解析する。異常が見られた場合、胎生15日目まで胎生期を遡って腎を採取し、異常発生時期を特定する。
蛋白尿誘導時におけるSV2B遺伝子の機能解析を、SV2B遺伝子ノックアウトマウスを用いて行う。具体的には、adriamycin（ADR）や大量のpuromycin aminonucleoside（PAN）を投与し、実験的ネフローゼモデルを作製する。これら病態マウスのスリット膜の構造異常やスリット膜機能分子の発現・局在変化を、平成24年度研究実施計画と同様の手法を用いて解析する。また、これら病態マウスに各種化合物、生物製剤（ブロッキング抗体）を各種経路（経口、筋肉内、腹腔内、皮下、静脈内）にて投与し、蛋白尿などの各種病変マーカーに対する改善効果の有無を解析する。
また、ポドサイト特異的遺伝子ノックアウトマウスを作製するため、新潟大学脳研究所附属生命科学リソース研究センターの協力の下、DNAインジェクション法を用いてPodocinプロモーターにより制御されるタモキシフェン誘導性Cre（CreERT2）トランスジェニックマウスの作製を進める。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
研究遂行に必要な培養装置、泳動装置、遠心器などの備品は、現有のものを利用する。分子の発現動態、機能解析に必要な抗体類、PCR用試薬、遺伝子・蛋白質抽出のための試薬類、培養に必要なプラスチック製品類を消耗品費として申請する。in vivoでの発現解析に必要な実験動物を維持費として申請する。これらの購入費用・解析費用は、必要不可欠である。
本研究により得られた成果は、腎臓病の治療に寄与すると考えている。その研究成果を積極的に公表するため、国内学会及び国外学会における成果発表経費も必要不可欠であると考える。
以上、今回申請した研究経費は、本研究を遂行するために必要不可欠かつ妥当な額であると考えている。
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