小児難治性てんかんにおける脳形成異常発生病態解明のための生物化学的研究

2012 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 24791081
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Research Institution: Nara Medical University
• Principal Investigator: 榊原 崇文 奈良県立医科大学, 医学部, 助教 (60570075)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: 限局性皮質異形成 / 難治性てんかん

Research Abstract

本研究は、小児難治性てんかんの大部分を占める限局性皮質異形成（FCD)の発生およびてんかん原生獲得の病態解明を目的として、神経幹細胞分化における時間的・空間的に制御されたエピジェネティクス制御機構が、FCDの発生および神経細胞機能に及ぼす影響を明らかにすることを目的としている。初年度は、FCDにおけるエピジェネティクス制御機構の定性的解析として、Mastroeniら（2010)のアルツハイマー病における報告を参考に、免疫組織化学的手法を用いた検討を行った。まず、皮質層構造の異常のみを示すFCD type Iと特異的な細胞であるBalloon cells(BCs)をもつFCD type IIbについて、DNAメチル化状態の指標とされる5-methylcytosine(Methyl-CpG)と5-methylcytidine(5-MeC) による免疫組織染色を行った。FCD type IおよびIIbの皮質神経細胞およびBCsにおけるMethyl-CpGおよび5-MeCそれぞれの核染色陽性率の低下はなかった。次に、BCs発生におけるエピジェネティクス機構の関与を明らかにするためDNAチップを用いて、BCsを含む組織と含まない組織におけるエピジェネティクス関連タンパク質のmRNA発現量について比較を行った。BCsを含む組織と含まない組織の間でDNMT1, MBD1, MBD2やHDAC1 などのmRNA発現量に差を認めなかった。免疫組織学的手法およびDNAチップを用いた今回の検討からは、FCDにおけるエピジェネティクス機構の関与を定性的に明らかにすることはできなかった。今後、ヒト培養神経芽細胞を用いて、FCD発生へのエピジェネティクス制御機構の関与を明らかにしていく。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

初年度に予定した研究の目的である限局性皮質異形成（FCD）におけるエピジェネティクス機構の関与について、免疫組織学的手法およびDNAチップを用いた検討を試みたが、その関与について明らかにすることが出来なかった。次に培養ヒト神経芽細胞による異型細胞形成の解析を開始することとした。当初培養ヒト神経芽細胞としてNT2を予定していたが、SH-SY5Y細胞を使用することとなった。このため細胞培養、分化誘導や細胞溶解の条件設定に時間を要している。このため、当初予定していた解析開始に時間を要している。

Strategy for Future Research Activity

本年度からは、培養ヒト神経芽細胞を用いて、分化誘導を行い、各分化段階におけるValproic acidによるヒストンアセチル化阻害やGFAP発現ベクター導入によりFCDに特異的なdysmorphic neuronやballoon cellの形態再現を試みる。さらにこれらの阻害剤（siRNAなど)による回復実験を行い、神経細胞分化過程におけるエピジェネティクス機構の障害によるFCDの形態形成病態を明らかにする。そして、誘導された神経細胞間における機能的な違いについても解析を行い、てんかん原生形成の病態を解明する。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

次年度の研究費は、主に細胞培養関連試薬、分化誘導およびヒストンアセチル化阻害などに使用する薬剤、ウエスタンブロッティングや細胞染色に使用する抗体（免疫組織学的試薬）、細胞への遺伝子導入にかかわる試薬（遺伝子工学的試薬）などに対して使用する。研究成果が得られた場合は、その発表や論文校正にかかる費用の一部として使用する。