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2012 Fiscal Year Research-status Report

患者iPS細胞とモデルラットによる女性に限定されるてんかんと精神遅滞の病態研究

Research Project

Project/Area Number 24791095
Research Category

Grant-in-Aid for Young Scientists (B)

Research InstitutionFukuoka University

Principal Investigator

日暮 憲道  福岡大学, 医学部, 助手 (40568820)

Project Period (FY) 2012-04-01 – 2014-03-31
Keywordsてんかん / 女性 / 遺伝子 / iPS細胞 / 疾患モデル動物
Research Abstract

本研究は、患者由来iPS細胞と疾患モデルラットを用い、PCDH19関連てんかん(旧病名: 女性に限定されるてんかんと精神遅滞)の分子細胞レベルでの発症病態の解明を目指すものである。
H24年度は患者由来iPS細胞を1例から樹立、クローン選択をすすめ、また、分化神経細胞でのPCDH19発現について検討した。PCDH19発現は、細胞間の差異はあるものの多数の細胞で発現しており、特に樹状突起(分岐部、肥厚部、棘など)や細胞体などに認められた。
PCDH19ノックアウトラットの作成も同時に進めているが、H24年度終了時点ではまだ個体は出来ていない。
その他PCDH19関連分子の同定のため、タグつきPCDH19 cDNAをHela細胞やSHSY5Y細胞などに発現させ免疫沈降実験を試みたが、候補分子の同定には至らなかった。このため酵母のツーハイブリッド法による同定を試み、現在多数の陽性遺伝子が同定されたため、来年度は引き続き、同定された遺伝子の絞り込みと、その関連分子としての妥当性を検討する実験を継続していく。
さらにH24年度は臨床的検討もすすめ、10例の新規患者を同定した。これまでに同定した症例の臨床的見地からは、炎症機序などがてんかんの発症、あるいは修飾因子に関わっている可能性が示唆されたため、現在精力的に患者血清や髄液などを用いて、免疫病態の解明を進めている。
本題とは別であるが、PCDH19関連てんかんと臨床的に類似したドラベ症候群と言われる、乳児期発症難治てんかんについて、患者由来iPS細胞を樹立し、種々の検討から電気生理学的異常の同定に成功し、今後のてんかんの病態研究に、患者由来iPS細胞が有用であることを示すことが出来たことは、非常に有意義である。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当初順調にいくと予測していたiPS細胞のクローンの選択と疾患モデルラットの作成が予想外に困難であった。
特に前者については、樹立したiPS細胞クローンの分化傾向が強く、神経分化効率が悪いラインが大半であったことに加え、クローン毎にX染色体の不活化が父方アレル、あるいは母方アレルに偏っているラインを探索してきたが、RNA発現や免疫染色の検討からはクリアに分別できなかった。
また、モデルラットの作成はTALENを用いているが、上手く遺伝子破壊に至らず、ラット個体の誕生に至っていない。
その他の実験計画についてもクリアに結果がでないこのが多く、実験手法の再検討が必要な状況である。

Strategy for Future Research Activity

今後もiPS細胞のクローン選択や疾患モデルラットの作成は継続していくが、iPS細胞の再樹立には時間もかかることから、まずはモデルラットの作成と、現在中途段階である酵母ツーハイブリッドにより選別された候補遺伝子のさらなる絞り込みと、その妥当性の検討を中心に進めていく。
さらに、実際の症例の臨床的検討と、血清や髄液などを用いた免疫病態の解明については、今後適切な治療を検討する上でも大変重要であるため、積極的に進めていく。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

疾患モデルラットの作成と、個体が完成した場合の飼育費用、さらに生化学的、免疫組織学的、電気生理学的実験の費用にあてる。また、PCDH19関連分子の同定に関わる、生化学的実験の費用や、患者検体の免疫学的、免疫組織学的検討などに関わる費用についても充当する。
繰越金が生じた理由はラットの個体がまだ出来ていないためである。H25年度の研究費は主にラット作成・飼育費用と、iPS細胞培養に関わる培地・ディッシュなどの消耗品、生化学実験・免疫組織実験などに必要な試薬・抗体・消耗品などに充当する予定である。また、患者検体の検査費用などにも一部利用する。

  • Research Products

    (8 results)

All 2013 2012

All Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 2 results) Presentation (6 results) (of which Invited: 2 results)

  • [Journal Article] PCDH19-related female-limited epilepsy: Further details regarding early clinical features and therapeutic efficacy2013

    • Author(s)
      Higurashi N., et al.
    • Journal Title

      Epilepsy Research

      Volume: im press Pages: im press

    • DOI

      10.1016/j.eplepsyres.2013.04.005

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] A human Dravet syndrome model from patient induced pluripotent stem cells2013

    • Author(s)
      Higurashi N., et al.
    • Journal Title

      Molecular Brain

      Volume: 6 Pages: 19

    • DOI

      doi:10.1186/1756-6606-6-19

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] 患者由来iPS細胞によるDravet症候群モデルの確立と分化GABA性神経細胞における機能低下2013

    • Author(s)
      日暮憲道、他
    • Organizer
      第47回日本てんかん学会
    • Place of Presentation
      北九州市
    • Year and Date
      20131011-20131012
  • [Presentation] A new research platform for Dravet syndrome using patient-derived induced pluripotent stem cells2013

    • Author(s)
      Higurashi N., et al.
    • Organizer
      XII Workshop on Neurobiology of Epilepsy (WONOEP 2013)
    • Place of Presentation
      カナダ ケベック州ローレンシャン
    • Year and Date
      20130620-20130622
  • [Presentation] PCDH19関連てんかんにおける発症初期の臨床的特徴と治療効果の検討2013

    • Author(s)
      日暮憲道、他
    • Organizer
      第55回日本小児神経学会学術総会
    • Place of Presentation
      大分市
    • Year and Date
      20130530-20130601
  • [Presentation] Modeling Dravet syndrome using induced pluripotent stem cells2013

    • Author(s)
      Higurashi N., et al.
    • Organizer
      Pediatric Academic Societies Annual Meeting 2013
    • Place of Presentation
      米国 ワシントンDC
    • Year and Date
      20130504-20130507
  • [Presentation] Challenges in The Establishment of A Dravet Syndrome Model Using Patient-Derived iPS Cells.2012

    • Author(s)
      Higurashi N., et al.
    • Organizer
      Korean Epilepsy Congress 2012
    • Place of Presentation
      大韓民国 仁川
    • Year and Date
      20120607-20120609
    • Invited
  • [Presentation] Dravet Syndrome or EFMR, What Is The Difference? – Can You Tell The Difference?2012

    • Author(s)
      Higurashi N., et al.
    • Organizer
      International Child Neurology Congress & 11th Asian & Oceanian Congress of Child Neurology
    • Place of Presentation
      オーストラリア ブリスベン
    • Year and Date
      20120528-20120601
    • Invited

URL: 

Published: 2014-07-24  

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