生体内環境を模倣した革新的三次元培養技術に基づく軟骨幹／前駆細胞の培養法の検証

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 24791911
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 矢吹 雄一郎 横浜市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 客員研究員 (30610357)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: RWV / 自家血清 / 軟骨幹細胞 / 軟骨前駆細胞

Outline of Annual Research Achievements

平成24年度は手術施行した小耳症症例のうち7例において検証した。供与を受けた血液からは血清を問題なく生成できた。自家血清含有培地とFBS含有培地でそれぞれ軟骨膜由来細胞の拡大培養を行った。MTTアッセイで増殖曲線を作成し、細胞倍加時間を算出したところ、10％自家血清含有培地においては約70時間、10％FBS含有培地においては約115時間であった。各血清を用いて拡大培養した細胞群を軟骨分化誘導した。培養上清に含まれる可溶性グリコサミノグリカンを測定したところ、各群ともに含有蛋白量の上昇を認めた。RT-PCRでアグリカン遺伝子の発現解析を行った。各群ともに、軟骨分化誘導によって遺伝子発現量が2倍に上昇した。RWVを用いた培養法における組織再構築能の評価として、まずはコントロールとして重症免疫不全マウスにおいて皮下移植実験を行った。再構築された組織の組織学的解析を行い、両群ともに弾性軟骨様であることがわかった。これらの結果は第21回日本形成外科学会基礎学術集会で報告した。
平成25年度においては、手術を施行した小耳症症例4例において検証を行った。とくに十分に自家血清が得られた症例(n=1)において、拡大培養した軟骨膜由来細胞をRWV内へ挿入し8週の期間において三次元培養したところ、組織の再構築を認めた。再構築された組織を両群で比較検討したところFBS含有培地使用群の方が自家血清含有培地使用群より大きさ、形状ともに安定的であった。組織学的に検証したところ、いずれの群においても軟骨様組織の再構築を認めたが、軟骨組織としては未熟なものであった。
平成26年度においては、本研究成果を英文医学誌へ報告・投稿するにあたり不足している部分の追加検証を行った。それらをもとに現在論文の投稿準備段階にある。