2012 Fiscal Year Research-status Report
表皮角化細胞にけるβ４インテグリンのエンドサイトーシスの解明
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24791914
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| Research Institution | Osaka City University |
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Principal Investigator |
小澤 俊幸 大阪市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 病院講師 (50570602)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2014-03-31
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| Keywords | β4-integrin |
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| Research Abstract |
ヘミデスモゾーム構成タンパクであるβ4-integrinのエンドサイトーシスの経路を解明することを目的とする。具体的には、GFP-β4-integrinを表皮角化細胞に遺伝子導入後、運動条件およびVGEF投与下で4D live cell imaging methodsを用い細胞質内の挙動を観察する。次にエンドサイトーシスがクラスリン、カベオリン、マクロピノのいずれに依存するのかを阻害剤投与およびsiRNAを行い同定する。最後に、受け渡しタンパクであるRabの種類も阻害剤とsiRNAを行い解明することを目的とする。今年度はNHEK細胞にGFP-β4-integrinを遺伝子導入し、基底膜から細胞質内に移動するβ4-integrinを4D Live cell imagingで検討することを目標にしてきたが、NHEK細胞に遺伝子導入する条件設定が難しく、Live cell imagingが出来ていない。予備実験としてHaCat細胞で行った場合は観察できているため、HaCat細胞に細胞腫を変更することも考慮に入れる。染色ではクラスリン、カベオリン、マクロピノサイトーシスの特異たんぱく質で染色できることを確認している。β4-integrinと同様にヘミデスモゾームを構成するBP180に関してはHaCat細胞に於いて、上記の方法を用いてLive cell imagingを行うことにより、そのエンドサイトーシス機序がマクロピノサイトーシスであることが解明された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初考えていた NHEK 細胞には遺伝子導入が難しい事が判明した。よって、細胞腫をNHEKからHaCat細胞に変更し、当初の実験を行うことを目的とする。細胞は療法とも人由来であるため、結果には大きく影響しない物と考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
▼ NHEK細胞にGFP-β4-integrinを遺伝子導入し、基底膜から細胞質内に移動するβ4-integrinを4D Live cell imagingで検討する。その後、運動条件およびVGEF投与条件で同様に観察する。
▼ 上記の条件で、クラスリン阻害薬（hypertonic sucrose、PAO、クロルプロマジン）、カベオリン阻害剤（メチル-β-シクロデキストリン、genistein、nystatin、indomethacin）、マクロピノサイトーシス阻害剤（cytochalasin D、EIPA）を使用し、ノーマル条件と比較することにより初期のエンドサイトーシスが何に依存するのかを解明する。
▼ 次に、エンドサイトーシスされたβ4-integrin はRab蛋白と結合することが予想されるので、初期エンドソームからリサイクリングエンドソームおよび後期エンドソームに関わるRabタンパクを同定する。現在Rab蛋白は６０種類程度存在していることが報告されている。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
上記の内容を遂行すべく、細胞種を変更して実験を行う。
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[Presentation] Bullous pemphigoid IgG induces BP180 internalization through clathrin and caveolin- independent endocytic pathway.2012
Author(s)
Sho Hiroyasu, Toshiyuki Ozawa, Hiromi Kobayashi, Masamitsu Ishii, Teruichi Harada, Yumi Aoyama, Yasuo Kitajima, Takashi Hashimoto, Jonathan C Jones and Daisuke Tsuruta
Organizer
The 72th Annual Meeting of the Society for investigative Dermatology
Place of Presentation
526 Superior Avenue East,Suite 540 Raleigh,United States Of America
Year and Date
20120509-20120512
