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2012 Fiscal Year Research-status Report

バイオフィルム形成ロシア・ミューシラジノーサの遺伝子解析

Research Project

Project/Area Number 24791975
Research InstitutionOsaka Dental University

Principal Investigator

山根 一芳  大阪歯科大学, 歯学部, 講師 (40388369)

Project Period (FY) 2012-04-01 – 2014-03-31
Keywordsバイオフィルム / Rothia mucilaginosa / 遺伝子
Research Abstract

菌体周囲に網目様の構造物を産生し、バイオフィルムを形成するロシア・ミューシラジノーサ DY-18株のコンピテントセルを調製した。このコンピテントセルを用いてカナマイシン耐性遺伝子をもつトランスポゾンをDY-18株のゲノムにエレクトロポレーション(ECM630 BTX社)し、本年度購入したラボ密度計(DMA4100M)と走査型電子顕微鏡を用いてスクリーニングしたところ、親株と比較して培養菌液の密度、粘度が低下し、菌体周囲の網目様構造物が欠失又は減少した株が3株得られた。
また、我々が既に明らかにしたDY-18株のゲノムの解析をさらに進めたところ、DY-18株のゲノム上には、主要シグマ因子(primary sigma factor)とextracytoplasmic function (ECF) sigma factorが1つずつ計2つのシグマ因子遺伝子しかないことが明らかになった。これはロシア・ミューシラジノーサの標準株であるATCC 25296株がもつ3つのシグマ因子より、さらに1つ少なかった。ECFシグマ因子は、環境ストレス応答や病原因子の産生に重要な役割を果たしていることが分かっている。DY-18株のECFシグマ因子も酸化ストレスへの応答に関与するレドックスモチーフを含むことから、周囲環境の酸化ストレスへの応答機構に関係していることが示唆された。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度は、カナマイシン耐性遺伝子をもつトランスポゾンを用いることで、ロシア・ミューシラジノーサ DY-18株のバイオフィルム非形成変異株を樹立することが出来た。
また、我々が既に明らかにしているDY-18株のゲノム配列の情報を用いて、細菌の病原性発現に重要なシグマ因子についての知見を得ることが出来た。今回見出したECFシグマが、ロシア・ミューシラジノーサのバイオフィルム形成の調節に直接関与するという結果はこれまでのところ得られていないが、我々は他にもいくつかのストレス応答系が存在することを明らかにしており、ロシア・ミューシラジノーサのバイオフィルム形成調節機構の解明という本研究の目的は概ね予定通り進行していると言える。

Strategy for Future Research Activity

GS Junior system (Roche社)を用いて、樹立したロシア・ミューシラジノーサ DY-18株のバイオフィルム非形成変異株の全ゲノム配列を取得し、トランスポゾンの挿入箇所を明らかにする予定である。これによりトランスポゾンの挿入により不活性化した遺伝子のアノテーション情報から、パスウェイを推定することで、菌体外多糖合成経路を明らかにし、バイオフィルム形成に関与する遺伝子を解明することが出来ると考えている。
また、DY-18株を培養して経時的に菌液の粘度を測定し、菌体外多糖の産生量の変化を捉え、バイオフィルム形成状態の菌と浮遊状態の菌を得る。それぞれの菌体から、mRNAを抽出、精製し、逆転写してcDNAを作製する。ノックアウト株の菌体から抽出したmRNAを用いて同様にcDNAを作製する。これらのcDNAに対して、特定した遺伝子のRT-PCRをして遺伝子の発現レベルを比較する予定である。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

変異株ゲノムDNA解析のため、GS Junior systemを用いたパイロシークエンス用試薬などを購入する予定である。また、RNA抽出試薬、RT-PCR用試薬などを購入し、遺伝子の発現を解析する。

  • Research Products

    (18 results)

All 2013 2012 Other

All Journal Article (6 results) (of which Peer Reviewed: 6 results) Presentation (12 results)

  • [Journal Article] Biofilm-forming capacity on clinically isolated Streptococcus constellatus from an odontogenic subperiosteal abscess lesion2013

    • Author(s)
      Yamanaka T, Furukawa T, Yamane K, Nambu T, Mashimo C, Maruyama H, Inoue J, Kamei M, Yasuoka H, Horiike S, Leung KP, Fukushima H
    • Journal Title

      Journal of Bacteriology & Parasitology

    • DOI

      10.4172/2155-9597.1000160

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Identification of disulphide stress-responsive extracytoplasmic function sigma factors in Rothia mucilaginosa2013

    • Author(s)
      Nambu T, Yamane K, Yamanaka T, Mashimo C, Maruyama H, Yoshida M, Hayashi H, Fukushima H
    • Journal Title

      Archives of Oral Biology

      Volume: 58(6) Pages: 681-689

    • DOI

      10.1016/j.archoralbio.2012.10.017

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Identification of the genes involved in the biofilm-like structures on Actinomyces oris K20, a clinical isolate from an apical lesion.2013

    • Author(s)
      Mashimo C, Kamitani M, Nambu T, Yamane K, Yamanaka T, Tatami T, Inoue J, Kamei M, Morita S, Fukushima H
    • Journal Title

      Journal of Endodontics

      Volume: 39(1) Pages: 44-48

    • DOI

      10.1016/j.joen.2012.08.009

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Pathogenicity of exopolysaccharide-producing Actinomyces oris isolated from an apical abscess lesion2013

    • Author(s)
      Yamane K, Nambu T, Yamanaka T, Ishihara K, Tatami T, Mashimo C, Walker CB, Leung K.-P., Fukushima H
    • Journal Title

      International Endodontic Journal

      Volume: 46(2) Pages: 145-154

    • DOI

      10.111/j1365-2591.2012.02099.x

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] バイオフィルム形成Streptococcus constellatusのゲノム解析2013

    • Author(s)
      安岡大志,山根一芳,福島久典
    • Journal Title

      歯科医学

      Volume: 76(2) Pages: 印刷中

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Analysis of genes involved in exopolysaccharide production of Rothia mucilaginosa clinically isolated from a persistent apical periodontitis lesion2012

    • Author(s)
      Fujihira T, Yamane K, Yoshida M, Nambu T, Hayashi H
    • Journal Title

      Journal of Osaka Dental University

      Volume: 46(1) Pages: 157-164

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] Genetic analysis of biofilm-forming Streptococcus constellatus2013

    • Author(s)
      Yamane K, Yamanaka T, Mashimo C, Nambu T, Maruyama H, Walker CB, Leung K-P, Fukushima H
    • Organizer
      IADR/AADR/CADR General Session & Exhibition
    • Place of Presentation
      Seattle, Washington, USA
    • Year and Date
      2013-03-21
  • [Presentation] Characterization of Tn5 insertion mutants of oral Actinomyces affected in biofilm formation2012

    • Author(s)
      Nambu T, Mashimo C, Yamane K, Yamanaka T, Maruyama H, Fukushima H
    • Organizer
      Biofilms 5
    • Place of Presentation
      Paris, France
    • Year and Date
      2012-12-12
  • [Presentation] Sucrose independent exopolysaccharide productivity and biofilm formation of oral commensal bacteria as pathogenesis of chronic inflammation in the oral cavity2012

    • Author(s)
      Yamanaka T, Yamane K, Mashimo C, Nambu T, Maruyama H, Leung KP, Fukushima H
    • Organizer
      Clinical Microbiology and Microbial Genomics
    • Place of Presentation
      San Antonio, USA
    • Year and Date
      2012-11-12
  • [Presentation] Development of new plasmids for cloning and expression in oral Actinomyces spp.

    • Author(s)
      Mashimo C, Nambu T, Maruyama H, Yamane K, Yamanaka T, Fukushima H
    • Organizer
      The 4th EMBO Meeting 2012
    • Place of Presentation
      Nice, France.
  • [Presentation] 口腔アクチノマイセスにおけるバイオフィルム欠損株の同定と特徴づけ

    • Author(s)
      南部 隆之, 真下 千穂, 山根 一芳, 山中 武志, 福島 久典
    • Organizer
      第86回日本細菌学会総会
    • Place of Presentation
      千葉市
  • [Presentation] pJRD215を基盤にしたクローニング・発現用プラスミドの作製とActinomyces属細菌への応用.

    • Author(s)
      真下 千穂, 南部 隆之, 山根 一芳, 山中 武志, 福島 久典
    • Organizer
      第86回日本細菌学会総会
    • Place of Presentation
      千葉市
  • [Presentation] バイオフィルム形成Streptococcus constellatusのゲノム解析

    • Author(s)
      安岡 大志, 山根 一芳, 福島 久典
    • Organizer
      大阪歯科学会例会
    • Place of Presentation
      枚方市
  • [Presentation] 口腔アーキアによって疾患は起こるか?

    • Author(s)
      円山 由郷, 山根 一芳, 南部 隆之, 真下 千穂, 山中 武志, 福島 久典
    • Organizer
      日本歯科医学会総会
    • Place of Presentation
      大阪市
  • [Presentation] 口腔感染症の病因論が変わった

    • Author(s)
      山根 一芳, 円山 由郷, 南部 隆之, 真下 千穂, 山中 武志, 福島 久典
    • Organizer
      日本歯科医学会総会
    • Place of Presentation
      大阪市
  • [Presentation] 矯正線表面へのActinomyces oris MG‐1株の付着性

    • Author(s)
      大前 有紀, 山根 一芳, 南部 隆之, 松本 尚之
    • Organizer
      日本矯正歯科学会大会
    • Place of Presentation
      盛岡市
  • [Presentation] 口腔膿瘍から分離したStreptococcus intermediusのゲノム解析

    • Author(s)
      山根 一芳, 南部 隆之, 真下 千穂, 山中 武志, 福島 久典
    • Organizer
      歯科基礎医学会学術大会・総会
    • Place of Presentation
      郡山市
  • [Presentation] バイオフィルム形成Streptococcus intermediusのゲノム解析

    • Author(s)
      山根 一芳, 山中 武志, 真下 千穂, 吉田 匡宏, 林 宏行, 南部 隆之, 円山 由郷, 福島 久典
    • Organizer
      日本歯科保存学会
    • Place of Presentation
      宜野湾市

URL: 

Published: 2014-07-24  

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