ヒトｉＰＳ細胞の誘導効率を高める新規初期化因子の発見

2012 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 24792197
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Research Institution: Gifu University
• Principal Investigator: 玉置 也剛 岐阜大学, 医学部附属病院, 助教 (40585303)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: Dlx4

Research Abstract

我々はさまざまな歯の発達段階（歯冠完成期； CC、歯根形成期； RF、歯根完成期；RC）由来のDPC株を200株ほど樹立し、保有してきた。この中から9ラインのDPC株を選んで、レトロウィル法を用いて山中４因子を遺伝子導入し、iPS細胞の誘導効率について検討したところ、RC期に比べCC期やRF期では著明に誘導効率が高いことが分かった。次にCC期とRF期から4株、RC期から4株の細胞株を選び、DNAマイクロアレイ解析を行い、CC期とRF期のグループに特異的に高発現している遺伝子をピックアップした（5倍以上の遺伝子をピックアップ）。ピックアップした遺伝子の中に、Tgf-bシグナルを抑制するDlx4という遺伝子があるのが分かった。Tgf-bシグナルを抑制することでiPS細胞の誘導効率が向上することはいくつかの論文で報告されているため、我々はこれに注目し、real-time PCRでさまざまなDPC株のDlx4の発現量を解析した。するとDNAマイクロアレイと一致して、RC期に比べ、CC期やRF期は著しくDlx4の発現が高いことが確認できた。次にDlx4がiPS細胞誘導において、重要な役割を担うあどうか検討するために、pMXベースのDlx4発現レトロウィルベクターを作製した。DP31という株を用いてDlx4の効果を解析した。DP31はOct3/4とSox2（OS）の2因子のみでもiPS細胞への誘導が可能だが、この場合の誘導効率は著しく低い。しかしOSにDlx4を加えた3因子（OSD）は著しく誘導効率を上げることができた。誘導効率は従来の3因子（OS+Klf4；OSK）と同程度まで高めることができた。さらにOSKにDlx4を加えた場合でも誘導効率は著明に高まり、山中4因子（OSKM）と同程度まで高めることができることが分かった。次に皮膚線維芽細胞でもDlx4の効果があることを確認した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

1年目ですでにiPS細胞の誘導効率を高める新遺伝子の同定ができた。またこの遺伝子が歯髄細胞や皮膚線維芽細胞のiPS細胞化に効果があることを確認した。さらにOSDで誘導されたiPS細胞の未分化性と多分化能について解析を行った（Dlx4は誘導効率を高めるだけでなく、成熟したiPS細胞にまで誘導できることを確認した）。

Strategy for Future Research Activity

今後はDlx4がIPS細胞化の際に必須因子であるかどうかの検討を行う。すでにDlx4に対するsiRNA発現レトロウィルベクターを作製し、DP31のsiRNA-Dlx4株を樹立した。今後この細胞株のiPS誘導効率を検討していく。またDlxは本当にTgf-bシグナルを抑制することで、iPS細胞化の効率を高めているのかどうか今後検討する必要がある。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

1年目の研究の進行が予想よりも速かったことから、予定していた予算よりも少ない額で予定していた解析を終えることができた。そのため次年度に1万9千円ほど繰り越すことができ、これらの費用は次年度の消耗品購入に使用する。
また今後はウェスタンでDlx4とTgf-bシグナルの関係を解析する必要があるため、Tgf-bシグナル関連の抗体の購入が必要である。また培養に必要な培地の購入が主な研究費の使用予定である。