2012 Fiscal Year Annual Research Report
コラーゲン３重らせんペプチドを利用したＰＥＤＦ血管新生阻害の分子機構の解明
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24810026
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| Research Institution | Waseda University |
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Principal Investigator |
増田 亮 早稲田大学, 理工学術院, 助手 (90632159)
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| Project Period (FY) |
2012-08-31 – 2014-03-31
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| Keywords | 血管新生 / PEDF / コラーゲン / ヘパリン / HSPG / コラーゲンペプチド / 創傷治癒モデル / スクラッチアッセイ |
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| Research Abstract |
色素上皮由来因子 (PEDF) は、血管新生を強く阻害する生体分子として知られている。その作用機序は未だ不明であり、様々な検証が行われているが、決定的な解明には至っていない。申請者は、所属研究室が以前に発見したPEDFとヘパラン硫酸が、コラーゲン上で競合的に相互作用するという知見に基づき、血管新生阻害作用との関連を調査することとした。
本相互作用を検証するためには、in vitroにおける血管新生の評価系の構築が不可欠である。そこで、ヒト臍帯静脈内皮細胞 (HUVEC) を用いた創傷治癒モデルを用いることとし、その実験条件を精査した。まず、培地中に含まれるヘパリンを除いた系を検証したところ、アッセイ系が機能することが示された。つづいて、アッセイ前に行うブロッキング濃度の最適化を行い、高いS/Nを得ることができるアッセイ系の構築に成功した。つづいて、PEDF存在下、本アッセイ系を行ったところ、過去の知見通り、HUVECの移動が阻害されている様子を観察することができた。さらなる精査を行うため、ヘパリンやPEDFと特異的に相互作用するコラーゲンペプチドをFmoc固相合成法で調製し、またヘパリンおよびコラーゲンへの結合能を欠損したPEDF変異体を大腸菌の形質転換することにより得た。現在、これらの化合物とともに、ヘパリンやヘパリン阻害剤であるプロタミンを用いた条件、あるいはそれらの共存条件下でアッセイを行っている。
今後は、血管新生において、これらの化合物一つ一つが果たす役割を解明するために、創傷治癒モデルによる精査を続けるとともに、管腔形成アッセイを行い、それらの結果の裏付けを行う。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
現在、上記相互作用を検証するために必要な化合物を調製し、アッセイの最適条件を検討したところである。本アッセイ系を用いて、それらの化合物が血管新生における役割を精査している。それらの結果は再現性がよく、また高いS/N比を持っているため結果の考察が容易となった。そのため、現段階で研究状況で問題となっていることはない。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き、創傷治癒モデルを用いて、複数の化合物が共存した条件でのアッセイを行う。その際、ある特定の相互作用のみを検証できる実験系を組み立てることで、その分子が血管新生において担っている役割を精査していく。また、管腔形成アッセイを行い、さらなる結果の裏付けを行う。
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