Development of Artificial Periosteum by Direct Re-Programming Method - Aiming at Multi-species Cellular Environment and Angiogenesis

2024 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 24K12423
• Research Institution: Kyoto Prefectural University of Medicine
• Principal Investigator: 寺内 竜 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (20575154)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 白井 寿治 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (20397186) ; 下村 征史 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 客員講師 (50935393)
• Project Period (FY): 2024-04-01 – 2027-03-31
• Keywords: 人工骨膜 / 再生医療 / 悪性骨腫瘍 / 自家液体窒素処理骨移植術

Outline of Annual Research Achievements

本年度は、ヒト皮膚線維芽細胞から骨芽細胞へdirect reprogrammingさせる手技を習得した。レトロウイルスベクターを用いてRunx2, Osterix, Oct4, L-Mycの4遺伝子（RXOL）を導入することで、ALP染色やアリザリンレッド染色で良好な染色を確認することができた。さらにRT-PCRでも骨形成マーカー遺伝子の発現上昇を認めており、問題なく骨芽細胞に分化誘導できていることが判明した。
次に、上記の4遺伝子に加えてVEGF遺伝子も導入して評価した。VEGF遺伝子を導入しても染色性は失われず、骨形成マーカー遺伝子の発現も上昇していた。さらにELISAでVEGFの分泌量が有意に増加していることも確認できた。VEGF遺伝子を追加導入することで、骨芽細胞への分化能を保ちつつVEGFを産生することが示された。
さらにin vivoの実験として、移植する細胞の数や用いるマウスの種類、大腿骨を掘削する幅や長さ、飼育期間などの検討を行った。ヒト皮膚線維芽細胞にRXOLを導入した細胞を作製した骨孔に注入し、採取後にμCTで確認したところ骨癒合が進んでいることが確認できた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

in vitroの実験で想定通りの結果を得ることができた。in vivoの実験についても条件検討ができており、次の実験へと進める準備が整っている。

Strategy for Future Research Activity

今後はin vivoの実験を進める予定である。NOD/Scidマウスの大腿骨に骨孔を作製し、RXOLを導入した細胞、RXOLとVEGFを導入した細胞、コントロール（ヒト皮膚線維芽細胞）を移植し、骨形成の程度をμCTと組織標本で確認する。さらにCD31免疫染色によって血管新生についても評価を行う予定である。