2024 Fiscal Year Research-status Report

Evaluation of structural variants and splice variants associated with IRD

Research Project

Project/Area Number	24K12796
Research Institution	独立行政法人国立病院機構(東京医療センター臨床研究センター)
Principal Investigator	岡本晶子 (須賀) 独立行政法人国立病院機構(東京医療センター臨床研究センター), 分子細胞生物学研究部, 研究員 (70450400)
Project Period (FY)	2024-04-01 – 2027-03-31
Keywords	遺伝性網膜疾患 / ゲノム解析 / 構造変異 / 同義変異 / スプライシング
Outline of Annual Research Achievements	R６年度は主にミニジーンアッセイのベクター作成効率と評価系を確立することを目標とした。ベクターに挿入可能なできるだけ大きい構造変異および一塩基置換の間で実験系を比較することを目的とし、WGS結果から原因候補変異の有無を選別し終えた560検体から目的に合致した変異を選択した。その結果、桿体一色覚患者5家系に共通して見られたRPGRIP1 exon18欠損変異と、同じく杆体一色覚で既知の原因遺伝子であるCNGB1のエキソン内に検出されたアミノ酸は変化しないがSpliceAIで新規ドナーサイトが形成される可能性が高いと予想された1塩基置換（同義性変異）について、スプライスアッセイベクターを構築しミニジーンアッセイを行った。 HEK293T細胞にベクターを導入し、RNAを回収してRT-PCRによりRNA産物のサイズおよび配列を確認したところ、RPGRIP1 exon18欠損からはエキソン17-エキソン19が直接つながったRNAが合成され、途中にストップコドンができることが確認された。一方CNGB1の同義性変異はRNA産物の長さ、配列に影響しなかった。それぞれ1例ずつのため、同義性変異のスプライシングへの影響は予想スコアよりも低いのかミニジーンアッセイでは再現しにくいのかはさらに検討が必要である。また変異を挟んで遺伝子自体のエキソンを利用する場合とベクターに用意されているエキソンを利用する場合で変異の影響が異なる可能性もある。同義性置換を含む数塩基の変異の影響を検出するベクターデザインについて検討を進める。また挿入領域の長さを考慮すると検討できる変異の数が絞られるため、全ゲノム解析の結果から検討候補変異を探す作業も継続する。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 研究計画当初、ゲノムシーケンスを行い家系ごとに原因変異の絞り込みを行った199家系のうち22家系で遺伝子の一部の構造変異（複数エキソンの欠損など）、スプライス変異の可能性が高い同義変異、Aluの挿入が検出されたが、構造変異については欠損領域の長さ、同義変異を含むエキソンの両側のイントロン‐エキソンの長さを考慮して選別すると、ミニジーンアッセイ可能な変異の数は非常に少なくなった。上の条件を考慮して選別した変異についてはGatewayシステムによりスプライスアッセイ用ベクターへの挿入を簡便に行うことができ、培養細胞を用いたスプライスアッセイも簡便に行うことができた。
Strategy for Future Research Activity	当初想定していたよりも疾患原因候補の同定からスプライスアッセイに適した変異を選別する過程に時間がかかることが分かったので、まず候補の数を増やすために継続して行っている遺伝性網膜疾患患者の全ゲノム解析結果の判定に注力する。エキソン上の同義変異によるスプライス異常の可能性については、できるだけ両隣のエキソンまでを挿入できる候補を探す。候補数を十分確保してからプラスミド構築および細胞での実験を行う実験フローにする。
Causes of Carryover	購入物品の消費税分および支払い時に生じる振込手数料、また３月の出張（学会発表）で生じる交通費、宿泊費等を考慮して年度内の研究費額に収まるように執行していった結果、余剰分が出た。