2016 Fiscal Year Annual Research Report
クライオ電子顕微鏡による生体分子モーターの立体構造と機能の解明
Project/Area Number |
25000013
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Research Institution | Osaka University |
Principal Investigator |
難波 啓一 大阪大学, 生命機能研究科, 教授 (30346142)
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Project Period (FY) |
2013 – 2017
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Keywords | ナノマシン / 分子モーター / クライオ電子顕微鏡 / 単粒子像解析 / 立体構造 / 光学顕微ナノ計測 / べん毛モーター / ブラウン・ラチェット |
Outline of Annual Research Achievements |
骨格筋アクトミオシンの構造からその高速運動の仕組みを解明した(Nature Communications 2017a)。細胞質ミオシンとの比較により、骨格筋ではアクチン繊維に強結合した際ATP結合ポケットがより大きく開くことでADPとPiが即座に解離し、ATP再結合によりミオシンがアクチン繊維から急速に解離する仕組みを捉えた。さらに弱結合構造モデルにおける結合ボンドの繊維軸に非対称分布から、ミオシン解離時にそのブラウン運動を一方向に偏らせて筋収縮力を発生するブラウニアン・ラチェット機構に手掛かりを得た。これら2つが骨格筋アクトミオシンモーターの高速性と高いエネルギー効率を実現している。骨格筋の細いフィラメントの構造解析でも高分解能達成の目処が立ち、世界初のトロポニンの全体像が見え始めている。相同性の高いべん毛ロッドとフックの構成タンパク質では、複合体構造中での分子の向きと相対配置のわずかな相違がドライブシャフトとして堅く真っ直ぐなロッドと自在継ぎ手として柔軟に曲がるフックの違いを実現していることをクライオ電顕で明らかにし(Nature Communications 2017b)、同定した原因変異をフックタンパク質に導入してそれを証明した(Scientific Reports 2017)。べん毛モーターの回転子では34回回転対称性のリング構造を原子レベルで明らかにしつつある。固定子でも回転子と相互作用してトルク発生に関与する細胞質ドメインの形状を明らかにした(Scientific Reports 2016)。べん毛モーターの機能解析では高速回転モーターのステップ動作解析により、固定子プロトンチャネル中のプロトン移動と共役した固定子の構造変化が固定子・回転子の結合解離を制御し、その非対称な弱結合構造が回転ブラウン運動を一方向に偏らせるブラウニアン・ラチェット機構を提案した。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
骨格筋アクトミオシンのクライオ電顕による構造から分子モーターとしての高速性と高いエネルギー効率の仕組みを解明し、Nature Communicationsに論文発表した。べん毛ロッドとフックのクライオ電顕による構造からは、相同性の高いタンパク質が機械的性質のまったく異なる超分子複合体を実現できるというタンパク質の興味深い性質を解明し、これもNature CommunicationsとScientific Reportsに論文発表した。骨格筋の細いフィラメントの構造も詳細に見え始めており、筋収縮制御の仕組みを解明できる日も間近であると期待される。べん毛モーターの回転子・固定子の構造解析も原子レベルに近づいており、光学顕微ナノ計測による高速回転モーターの機能解析から得たトルク発生のブラウニアン・ラチェット機構モデルを構造的に検証できる日も近いと思われる。
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Strategy for Future Research Activity |
当該科研費によるプロジェクトと並行して日本電子(株)と共同開発してきた、高度に自動化した新型クライオ電子顕微鏡が2016年夏に稼働し、その制御ソフトの開発にもおおよそ目処がたって、テスト試料の酵素複合体では2日間のデータ収集と数日の画像解析により3.2Å分解能を達成した。この電子顕微鏡に冷陰極電界放射型電子銃を装着した試作装置では、X線結晶構造解析に匹敵する1.0Åに近い分解能を達成できる可能性も見え始めている。今後もクライオ電子顕微鏡と単粒子像解析法において一層の工夫をし、この技術を一段と進歩させて到達分解能と計測解析の時間短縮を図ることで、構造生命科学の主たる手法としての汎用化を目指す。そして、こういった技術進歩の結果を活用することで、べん毛モーターの回転子や固定子、骨格筋のアクトミオシンモーターやトロポミオシン・トロポニンを含む細いフィラメントのCaイオンによる筋収縮制御系、その他さまざまな生体超分子の立体構造解析を一層高い分解能で行い、分子モーターのブラウニアン・ラチェット機構など、動作メカニズムの解明と高効率なエネルギー変換機構の一層明確な基盤の確立を目指す。
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[Journal Article] Identical folds used for distinct mechanical functions of the bacterial flagellar rod and hook.2017
Author(s)
Fujii, T., Kato, T., Hiraoka, K. D., Miyata, T., Minamino, T., Chevance, F., Hughes, K. & Namba, K.
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Journal Title
Nat. Commun.
Volume: 8
Pages: 14276
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Bacterial flagella grow through an injection-diffusion mechanism.2017
Author(s)
Renault, T. T., Abraham, A. O., Bergmiller, T., Parados, G., Rainville, S., Charpentier, E., Guet, C. C., Tu, Y., Namba, K., Keener, J. P., Minamino, T. & Erhardt, M.
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Journal Title
eLife
Volume: 6
Pages: e23136
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Load- and polysaccharide-dependent activation of the Na+-type MotPS stator in the Bacillus subtilis flagellar motor.2017
Author(s)
Terahara, N., Noguchi, Y., Nakamura, S., Kamiike, N., Ito, M., Namba, K., Minamino, T.
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Journal Title
Sci. Rep.
Volume: 7
Pages: 46081
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Straight and rigid flagellar hook made by insertion of the FlgG specific sequence into FlgE.2017
Author(s)
Hiraoka, K. D., Morimoto, Y. V., Inoue, Y., Fujii, T., Miyata, T., Makino, F., Minamino, T. & Namba, K.
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Journal Title
Sci. Rep.
Volume: 7
Pages: 46723
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Periodicity in attachment organelle revealed by electron cryotomography suggests conformational changes in gliding mechanism of Mycoplasma pneumoniae.2016
Author(s)
Kawamoto, A., Matsuo, L., Kato, T., Yamamoto, H., Namba, K., Miyata, M.
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Journal Title
mBio
Volume: 7
Issue: 2
Pages: e00243-16
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Rearrangements of α-helical structures of FlgN chaperone control the binding affinity for its cognate substrates during flagellar type Ⅲ export.2016
Author(s)
Kinoshita, M., Nakanishi, Y., Furukawa, Y., Namba, K., Imada, K. & Minamino, T.
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Journal Title
Mol. Microbiol.
Volume: 101
Pages: 656-670
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Structural flexibility of the periplasmic protein, FlgA, regulates flagellar P-ring assembly in Salmonella enterica.2016
Author(s)
Matsunami, H., Yoon, Y.-H., Meshcheryakov, V. A., Namba, K. & Samatey, F. A.
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Journal Title
Sci. Rep.
Volume: 6
Pages: 27399
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Structural study of MPN387, an essential protein for gliding motility of a human pathogenic bacterium, Mycoplasma pneumonia.2016
Author(s)
Kawakita, Y., Kinoshita, M., Furukawa, Y., Tulum, I., Tahara, Y. O., Katayama, E., Namba, K. & Miyata, M.
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Journal Title
J. Bacteriol.
Volume: 198
Pages: 2352-2359
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] The terameric MotA complex as the core of the flagellar motor stator from hyperthermophilic bacterium.2016
Author(s)
Takekawa, N., Terahara, N., Kato, T., Gohara, M., Mayanagi, K., Hijikata, A., Onoue, Y., Kojima, S., Shirai, T., Namba, K. & Homma, M.
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Journal Title
Sci. Rep.
Volume: 6
Pages: 31526
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Structural stability of flagellin subunit affects the rate of flagellin export in the absence of FliS chaperone.2016
Author(s)
Furukawa, Y., Inoue, Y., Sakaguchi, A., Mori, Y., Fukumura, T., Miyata, T., Namba, K. & Minamino, T.
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Journal Title
Mol. Microbiol.
Volume: 102
Pages: 405-416
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] The architecture of the cytoplasmic region of type Ⅲ secretion systems.2016
Author(s)
Makino, F., Shen, D., Kajimura, N., Kawamoto, A., Pissaridou, P., Oswin, H., Pain M., Murillo, I., Namba, K. & Blocker, A. J.
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Journal Title
Sci. Rep.
Volume: 6
Pages: 33341
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Journal Article] High-resolution pH imaging of living bacterial cell to detect local pH differences.2016
Author(s)
Morimoto, Y. V., Kami-ike, N., Miyata, T., Kawamoto, A., Kato, T., Namba, K. & Minamino, T.
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Journal Title
mBio
Volume: 7
Pages: e01911-16
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Presentation] Visualization of 11-and 34-fold rotational symmetries in the MS ring of the bacterial flagellum by electron cryomicroscopy.2017
Author(s)
Kawamoto, A., Kaido, A., Kinoshita, M., Miyata, T., Minamino, T., Kato, T., Namba, K.
Organizer
OIST Workshop “Bacterial flagella, injectisomes & type Ⅲ secretion systems” joint with Annual Flagella Meeting
Place of Presentation
OIST(沖縄県国頭郡)
Year and Date
2017-03-02
Int'l Joint Research
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[Presentation] Elucidation of the directional switching mechanism of the bacterial flagellar motor by electron cryomicroscopy.2017
Author(s)
Miyata, T., Kato, T., Kawamoto, A., Makino, F., Namba, K.
Organizer
OIST Workshop “Bacterial flagella, injectisomes & type Ⅲ secretion systems” joint with Annual Flagella Meeting
Place of Presentation
OIST(沖縄県国頭郡)
Year and Date
2017-03-02
Int'l Joint Research
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[Presentation] Conformational rearrangement of F1hA is critical for flagellar type Ⅲ protein export.2017
Author(s)
Inoue, Y., Kinoshita, M., Kitano, A., Imada, K., Namba, K., Minamino, T.
Organizer
OIST Workshop “Bacterial flagella, injectisomes & type Ⅲ secretion systems” joint with Annual Flagella Meeting
Place of Presentation
OIST(沖縄県国頭郡)
Year and Date
2017-03-01
Int'l Joint Research
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[Presentation] In Vitro reconstitution of the protein export of the flagellar type Ⅲ secretion system by using the inverted membrane vesicles.2017
Author(s)
Terashima, H., Kawamoto, A., Tatsumi, C., Namba, K., Minamino, T., Imada, K.
Organizer
OIST Workshop “Bacterial flagella, injectisomes & type Ⅲ secretion systems” joint with Annual Flagella Meeting
Place of Presentation
OIST(沖縄県国頭郡)
Year and Date
2017-03-01
Int'l Joint Research
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[Presentation] 蛍光ラベルした細菌べん毛蛋白質のin vitro輸送測定系を用いた検出2016
Author(s)
戸野侃, 寺島浩行, 巽千夏, 川本晃大, 田端和仁, 上野博史, 松田知己, 永井健治, 野地博行, 難波啓一, 南野徹, 今田勝巳
Organizer
日本生体エネルギー研究会第42回討論会
Place of Presentation
名古屋工業大学(愛知県名古屋市)
Year and Date
2016-12-20
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[Presentation] Visualization of 11-and 34-fold rotational symmetries in the MS ring of the bacterial flagellum by electron cryomicroscopy.2016
Author(s)
Kawamoto, A., Kaido, A., Kinoshita, M., Miyata, T., Minamino, T., Kato, T. & Namba, K.
Organizer
第54回日本生物物理学会年会
Place of Presentation
つくば国際会議場(茨城県つくば市)
Year and Date
2016-11-27
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[Presentation] サルモネラ属菌FliFG融合変異型べん毛モーターの動態機能計測. Functional analysis of a FliFG deletion-fusion mutant flagellar motor.2016
Author(s)
Sakai, T., Mori, K., Inoue, Y., Miyata, T., Terahara, N., Morimoto, Y., Kato, T., Namba, K. & Minamino, T.
Organizer
第54回日本生物物理学会年会
Place of Presentation
つくば国際会議場(茨城県つくば市)
Year and Date
2016-11-27
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[Presentation] F1hAの構造変換がべん毛蛋白質輸送順序の決定に重要である. Conformational rearrangements of F1hA is critical for ordered protein export during flagellar assembly.2016
Author(s)
Inoue, Y., Ogawa, Y., Kinoshita, M., Imada, K., Namba, K. & Minamino, T.
Organizer
第54回日本生物物理学会年会
Place of Presentation
つくば国際会議場(茨城県つくば市)
Year and Date
2016-11-27
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[Presentation] 細菌べん毛Ⅲ型タンパク質輸送のin vitro再構築. In vitro reconstitution of the bacterial flagellar type Ⅲ protein export.2016
Author(s)
Terashima, H., Kawamoto, A., Tatsumi, C., Namba, K., Minamino, T. & Imada, K.
Organizer
第54回日本生物物理学会年会
Place of Presentation
つくば国際会議場(茨城県つくば市)
Year and Date
2016-11-27
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[Presentation] ユビキチン化に伴う蛋白質の凝集体形成. Ubiquitylation-induced protein aggregation.2016
Author(s)
Morimoto, D., Walinda, E., Fukada, H., Sugase, K., Hoshino, M., Fujii, T., Namba, K., Komatsu, M., Tanaka, K. & Shirakawa, M.
Organizer
第54回日本生物物理学会年会
Place of Presentation
つくば国際会議場(茨城県つくば市)
Year and Date
2016-11-26
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[Presentation] マウス繊毛細胞におけるDpcdの機能解析. Role of Dpcd in motile cilia of meice.2016
Author(s)
Tamegai, M., Kikumoto, M., Kinoshita, M., Kawamoto, A., Namba, K., Hamada, H., Imada, K., Narita, A. & Shinohara, K.
Organizer
第54回日本生物物理学会年会
Place of Presentation
つくば国際会議場(茨城県つくば市)
Year and Date
2016-11-26
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[Presentation] Direct observation of ring formation of the C-terminal cytoplasmic domain of a flagellar type Ⅲ export gate protein FlhA by high-speed atomic force microscopy.2016
Author(s)
Minamino, T., Terahara, N., Inoue, Y., Kodera, N., Ando, T. & Namba, K.
Organizer
4th Kanazawa Bio-AFM Workshop 2016
Place of Presentation
KKR ホテル金沢(石川県金沢市)
Year and Date
2016-10-05
Int'l Joint Research
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[Presentation] High resolutions structural analysis of the 100S ribosome.2016
Author(s)
Kato, T., Miyata, T., Ueta, M., Wada, A., Wada, C. & Namba, K.
Organizer
GRC on 3DEM
Place of Presentation
The Chinese University of Hong Kong, Hon Kong, China
Year and Date
2016-06-19 – 2016-06-24
Int'l Joint Research
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