2017 Fiscal Year Annual Research Report
クライオ電子顕微鏡による生体分子モーターの立体構造と機能の解明
Project/Area Number |
25000013
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Research Institution | Osaka University |
Principal Investigator |
難波 啓一 大阪大学, 生命機能研究科, 特任教授(常勤)
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Project Period (FY) |
2013 – 2018
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Keywords | ナノマシン / べん毛モーター / クライオ電子顕微鏡 / 単粒子像解析 / Cリング構造 / 回転スイッチ機構 / MSリング構造 / 輸送ゲート構造 |
Outline of Annual Research Achievements |
べん毛モーター回転機構の解明をめざして進めてきたべん毛基部体のクライオ電子顕微鏡による構造解析が有意に進捗し、αヘリックスやβシートなど2次構造が確認できるまで分解能が向上した。その結果、構成タンパク質の部分X線結晶構造を3次元密度マップに当てはめて信頼性の高い原子モデルを構築できるようになった。 基部体の細胞質側にあってモーターのトルク発生と回転方向の切り替えに関わるCリングでは、反時計方向あるいは時計方向にのみ回転する2種類のモーター基部体の密度マップに構成タンパク質FliG、FliM、FliNの部分結晶構造を当てはめることで、回転方向に依存した構造の違いを解明した。 Cリングの最上部にあって、膜貫通型プロトンチャネルである固定子複合体の細胞質ドメインと結合解離を繰り返すことでトルク発生を駆動するFliGのC末端ドメインは、反時計方向と時計方向にのみ回転するモーターではほぼ180°向きを変えることが明らかとなった。固定子は2回回転対称性を持ち、その細胞質ドメインも180°回転した部分構造を同時に有するため、それぞれが180°向きを変えたFliGのC末端ドメインと結合解離することでトルクを両方向に発生でき、モーターの反転も可能になると考えられる。 細胞膜を貫通するMSリング、それに結合したロッド、そして輸送ゲートの構造についても2構造が明確に見えるようになった。FliFを大量発現して精製したMSリングの構造解析でも明らかとなった34回回転対称性のリング構造とともに、それぞれ数分子から十数分子のFlgE、FlgB、FlgC、FlgF、FlgGからなるロッドの構造、そしてロッドの基部でMリングの中心部に位置するべん毛タンパク質3型輸送ゲートの構造も解像できた。固定子複合体についても原子レベルの構造解析を目指してナノディスクへの再構成によりクライオ電顕解析を進めている。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
細菌細菌べん毛モーターの回転機構の解明のために進めてきたべん毛基部体の構造解析は、細菌の細胞膜と外膜の両方を貫通する巨大な膜タンパク質複合体であるとともに、細胞質側にあってトルク発生と回転方向スイッチに関与するCリングの結合が不安定であるため、長年の努力にもかかわらず困難を極めた。 しかし、全体構造を安定化できる水溶液条件の発見、クライオ電顕像の解析法における工夫の着実な積み重ね、そして反時計方向および時計方向に回転する2種類のモーター基部体のそれぞれについて10,000枚を超える膨大数のクライオ電顕像の収集と解析により、ようやく両者ともに立体構造の分解能が2次構造を解像できるレベルに到達した。その結果、構成タンパク質の部分X線結晶構造を当てはめて信頼性の高い原子モデルの構築が可能になり、モーターのトルク発生と回転スイッチの機構について興味深いメカニズムが明らかになるとともに、多数のタンパク質が順序よく自己集合して構築されるべん毛基部体の自己構築メカニズムについても理解が深まった。
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Strategy for Future Research Activity |
当該科研費によるプロジェクトと並行して2010年から日本電子(株)と共同開発し、2016年夏にプロトタイプが完成した、高度に自動化された新型クライオ電子顕微鏡CRYO ARMが2017年春に安定稼働し、当初3.2Å分解能を達成したテスト試料の酵素複合体の構造解析では、2017年夏に自動撮影が可能になったこともあり、3日間で撮影した2500枚のクライオ電顕像から35万の分子像を得て2.6Åの分解能を達成し、局所分解能は2.0Åに近いことを確認した。 今後はこのCRYO ARMを活用し、単粒子像解析法の一層の工夫により到達分解能と計測解析の時間短縮を図ることで、べん毛モーターの回転子や固定子、骨格筋のアクトミオシンモーター、トロポミオシン・トロポニンを含む心筋の細いフィラメントのCaイオンによる筋収縮制御系、その他さまざまな生体超分子の立体構造解析を一層高い分解能で行う。そして、分子モーターのブラウニアン・ラチェット機構など、その動作メカニズムと高効率なエネルギー変換機構を解明し、生体分子ナノマシンが熱ゆらぎを活用することで実現している、人工機械には達成不可能なほど高効率なエネルギー変換のための動的分子構造メカニズムについて、一層明確な構造基盤の確立を目指す。
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[Journal Article] Insight into structural remodeling of the FlhA ring responsible for bacterial flagellar type Ⅲ protein export.2018
Author(s)
Terahara, N., Inoue, Y., Kodera, N., Morimoto, Y. V., Uchihashi, T., Imada, K., Ando, T., Namba, K. & Minamino, T.
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Journal Title
Sciences Advances
Volume: 4
Pages: eaao7054
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Insight into adaptive remodeling of the rotor ring complex of the bacterial flagellar motor.2018
Author(s)
Kinoshita, M., Furukawa, Y., Uchiyama, S., Imada, K., Namba, K. & Minamino, T.
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Journal Title
BBRC
Volume: 496
Pages: 12-17
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Tunnel formation inferred from the I form structures of the proton-driven protein secretion motor SecDF.2017
Author(s)
Furukawa, A., Yoshitaie, K., Mori, T., Mori, H., Ito, M., Morimoto, Y. V., Sugano, Y., Iwaki, S., Minamino, T., Sugita, Y., Tanaka, Y. & Tsukazaki, T.
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Journal Title
Cell Rep.
Volume: 19
Pages: 895-901
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Assembly and stoichiometry of the core structure of the bacterial flagellar type III export gate complex.2017
Author(s)
Fukumura, T., Makino, F., Dietsche, T., Kinoshita, M., Kato, T., Wagner, S., Namba, K., Imada, K., Minamino, T.
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Journal Title
PLOS Biol.
Volume: 15
Issue: 8
Pages: e2002281
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Na+-induced structural transition of MotPS for stator assembly of Bacillus flagellar motor.2017
Author(s)
Terahara, N., Kodera, N., Uchihashi, T., Ando, T., Namba, K. & Minamino, T.
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Journal Title
Science Advances
Volume: 3
Pages: eaao0419
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Presentation] High resolution structural studies and direct visual observation of Hsp 104 from Chaetomium thermophilum suggest the role of the spiral architecture.2017
Author(s)
Inoue, Y., Hanazono, Y., Noi, K., Kawamoto, A., Takeda, K., Noguchi, K., Namba, K., Ogura, K., Shinohara, K. & Yohda, M.
Organizer
EMBO Conference on Protein quality control : Success and failure in health and disease
Int'l Joint Research
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[Presentation] Metabolic profiling of thermos thermophiles HB8 reveals distinct metabolic states dependent on the temperature.2017
Author(s)
Tokuyama, K., Sakai, T., Toya, Y., Matsuda, F., Kuramitsu, S., Shimizu, H.
Organizer
IUMS 2017
Int'l Joint Research
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[Presentation] 蛋白質膜透過駆動モーターSecDF. Protein translocation motor SecDF.2017
Author(s)
Tsukazaki, T., Furukawa, A., Yoshikaie, K., Mori, T., Morimoto, Y. V., Sugano, Y., Iwaki, S., Minamino, T., Sugita, Y. & Tanaka, Y.
Organizer
第55回日本生物物理学会年会
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[Presentation] P1 adhesin, the leg for gliding of Mycoplasma pneumonia.2017
Author(s)
Matsumoto, U., Kawamoto, A., Kato, T., Kawakita, Y., Kenri, T., Mori, S., Namba, K. & Miyata, M.
Organizer
第55回日本生物物理学会年会
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[Presentation] Pressure-induced activation of the swimming motility of magnetotactic bacterium.2017
Author(s)
Nishiyama, M., Ruan, J., Shimogonya, Y., Kato, T., Minamino, T., Namba, K., Ishikawa, T., Seiyama, A., Wu, L. -W. & Harada, Y.
Organizer
第55回日本生物物理学会年会
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[Presentation] Structure and rotational symmetry of the rotor of the bacterial flagellar motor revealed by electron cryomicroscopy.2017
Author(s)
Kawamoto, A., Miyata, T., Kinoshita, M., Minamino, T., Kato, T. & Namba, K.
Organizer
第55回日本生物物理学会年会
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[Presentation] The role of a flexible linker of FlhA in substrate specificity switching of the bacterial flagellar type III export-apparatus.2017
Author(s)
Inoue, Y., Kida, M., Kinoshita, M., Imada, K., Namba, K. & Minamino, T.
Organizer
第55回日本生物物理学会年会
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[Presentation] Real-time imaging of Na+-induced structural transitions of MotPS stator complex of flagellar motor by HS-AFM.2017
Author(s)
Terahara, N., Kodera, N., Uchihashi, T., Ando, T., Namba, K. & Minamino, T.
Organizer
第55回日本生物物理学会年会
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[Book] Encyclopedia of Biophysics “Microscopy of Motor Structure and Possible Mechanisms.”2018
Author(s)
Minamino, T., Kato, T., Makino, F., Horvath, P., Miyata, T. & Namba, K.
Publisher
Springer-Verlag Berlin Heidelberg
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