2014 Fiscal Year Annual Research Report
in vivoイメージングプローブのデザイン・合成・生物応用
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25220207
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
菊地 和也 大阪大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (70292951)
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| Project Period (FY) |
2013-05-31 – 2018-03-31
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| Keywords | 化学プローブ / in vivoイメージング / 19FMRI / 蛋白質ラベル化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は（１）高感度19FMRIプローブの開発、（２）蛋白質の機能性分子ラベル化技術の開発を進め、下記の内容に取り組んだ。
（１）19FMRIは内在性バックグラウンドシグナルがほとんど存在しない為、生体に投与した造影剤の選択的なイメージングが可能である。申請者はこれまでに常磁性緩和促進（PRE）効果に基づいたシグナルOFF/ON型19FMRIプローブを開発してきた。しかし小分子プローブは、in vivoにおいて低感度という問題点があった。近年我々はナノ粒子型19FMRI造影剤FLAME（FLuorine Accumulated silica nanoparticle for 19F MRI Enhancement）を開発し、in vivoにおける高感度化に成功した。FLAMEは１分子内にフッ素を20個有する分子を脂質により内包し、その周りをシリカで被覆した構造をしている。シリカナノ粒子は生体内で安定であり、表面修飾による機能の付与も容易である。そこで本年度では、FLAMEにPRE効果によるOFF/ONスイッチング機構を導入し、生体内還元環境でシグナルが増大する19FMRI造影剤の開発に取り組んだ。
（２）in vivoイメージングに展開可能な細胞内蛋白質への機能プローブ導入法の開発に着手した。具体的には近赤外光に極大励起光及び発光を有する色素を、タグとなる蛋白質に特異的に結合するリガンドと連結した機能性蛍光プローブを開発した。一般的に近赤外蛍光を有する色素は脂溶性が高く、非特異的結合がイメージングする際に問題となっている。スルホ基などの官能基の導入は水溶性を上げるものの、プローブが細胞膜を透過せず細胞内タンパク質を標識できないという応用限界が生じている。そこで水溶性基の選択、及び導入部位の最適化を行い、非特異結合を大幅に抑制した近赤外色素のタンパク質標識化技術を確立した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
（１）ナノ粒子型19FMRI造影剤FLAMEにPRE効果によるOFF/ONスイッチング機構を導入し、生体内還元環境でシグナル増大を示す19FMRI造影剤の開発に取り組んだ。PRE効果とは、Gd3+錯体などの常磁性種が持つ不対電子スピンの影響で、近傍の観測核の横緩和時間T2が著しく減少する現象のことである。PRE効果には距離依存性があり、19FとGd3+の50%の効果距離は約4 nmであると示されている。そのため当初はナノ粒子内部の19Fと粒子表面のGd3+との間の距離が5 nm以上あるFLAMEではPRE効果が十分に機能しないことが危惧された。しかし、実際にGd3+錯体をFLAME表面に修飾すると、PRE効果によるT2短縮が観測された。この理由については、FLAME内の19Fの流動性により観測時間内に個々の19FとGd3+がPREの効果距離内に近づく可能性が高いためと考察している。この知見を基に、ジスルフィドリンカーを介してGd3+錯体をFLAME表面に修飾することで、還元環境下でシグナルがONとなる19FMRI造影剤の開発に成功した。
（２）われわれはこれまでに細菌由来のβラクタマーゼをタグとして用い、βラクタム環を有する蛍光プローブを標的タンパク質に特異的にラベル化する技術の開発を行ってきた。この技術をin vivoイメージングに展開するため、近赤外蛍光色素であるSiローダミンをβラクタム構造と連結したタンパク質ラベル化プローブを設計、合成した。しかしながら、合成したプローブは脂溶性が高く、標的タンパク質以外の非特異的な結合に由来する蛍光像が観察された。そこで非イオン性のオリゴエチレングリコールを色素とβラクタムの間のリンカーとして導入し、水溶性の調節を試みた。その結果、非特異的結合が大幅に抑制され、標的タンパク質を鮮明に近赤外蛍光色素でラベルすることが可能となった。
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| Strategy for Future Research Activity |
19F MRIプローブの開発においては、前年度で得られた知見を基に、酵素活性に応答してシグナルが増大するナノ粒子型のプローブを作製し生体に応用する。標的酵素としては免疫応答によって誘導されるインフラマゾームに関与しているカスパーゼ-1を選択する。カスパーゼ-1の基質を介し、Gd3+錯体をFLAME表面上に修飾したプローブを設計する。特に、酵素がナノ粒子上の複数の基質にアクセスする必要があるため、基質の長さ、リンカーにおいて検討しプローブを作製する。酵素反応をin vitroで行い、切断されたペプチド断片のHPLCによる分析、ならびにMRI撮像によるシグナル強度を評価することで最適化を行う。優れた特性を示すプローブを用い、マウス体内に投与しin vivoで免疫応答に伴うカスパーゼ-1の酵素活性をイメージングできるかどうかを検討する。
また、蛋白質への機能性分子のラベル化の際に開発していた、pH感受性蛍光プローブのデザイン・合成のノウハウを他のin vivoイメージング研究に応用することを企画する。破骨細胞は骨を溶解するときに酸を放出することが考えられる。そこで、破骨細胞が機能する骨表面にデリバリーされるpH感受性蛍光プローブを開発し、破骨細胞の機能を可視化する。われわれはこれまでの成果でBODIPY色素へのpH感受性の付与、またビスフォスフォネート基の導入による骨組織への効率的なプローブ送達といった知見を得ている。さらに色素に電子吸引基を導入することで活性酸素種に対する反応性が大幅に抑制され、光照射下でも蛍光強度が維持されることを明らかにしている。これらの成果を統合し、in vivoで二光子励起顕微鏡を用い、破骨細胞の機能を長時間にわたって観察できるプローブの開発に取り組む。
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