2016 Fiscal Year Annual Research Report
in vivoイメージングプローブのデザイン・合成・生物応用
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25220207
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
菊地 和也 大阪大学, 工学研究科, 教授 (70292951)
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| Project Period (FY) |
2013-05-31 – 2018-03-31
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| Keywords | 分子イメージング / in vivoイメージング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、機能性分子イメージングプローブをデザイン・合成し、生きた状態での生体内分子が有する生理機能の直接観測を行う。具体的には、１）高感度19F化合物含有 MRIナノ粒子型プローブの開発とin vivoイメージング、２）機能性小分子蛍光プローブ、および蛋白質の機能性分子ラベル化技術の開発及び生物応用を行う。これらの研究展開を行うことで、生物個体内の分子動態解析への応用や蛋白質の生体内ラベル化法が可能となり、化学を用いた新時代の生命科学研究を開拓することを目指す。
19FMRIプローブの開発に関しては、カテプシンKの活性検出を目指したプローブを作製した。ナノ粒子型プローブであるFLAMEの表面をカテプシンK基質であるペプチドを介し、シグナルをクエンチさせるGd錯体で修飾した。市販のカテプシンKとの酵素反応を行い、19FMRIシグナルを測定したところ、酵素反応に応じてシグナルの上昇が見られた。また、このプローブは他のカテプシン類であるカテプシンB、S、Lではほとんど応答せず、カテプシンKに対し高い特異性を持っていることが示された。
加えて、破骨細胞を長時間観察できる赤色蛍光プローブの開発を行った。これまでに開発した緑色蛍光プローブでは緑色蛍光タンパク質でラベルされたマウスには波長領域の重複により使用ができない。そこで赤色領域に蛍光波長を有するローダミン色素を母骨格としたpH応答性色素の開発に着手した。破骨細胞は活性化時に酸を放出し、その領域でのpHは4.5～6.0と言われている。この領域で蛍光を発するようにローダミン色素構造の改変を行った。特に、ローダミンのスピロ環化反応に着目し、中性では閉環しているが、弱酸性条件で開環し蛍光を発するように色素構造の置換基を検討した結果、優れたpH応答性を示すプローブを見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本年度はin vivoイメージングプローブとして、酵素活性を検出する19FMRIプローブの開発、破骨細胞活性を長時間観察できる蛍光プローブの開発を行った。
19FMRIプローブの開発に関しては、カテプシンKの活性検出を目指したプローブを作製した。ナノ粒子型プローブであるFLAMEの表面をカテプシンK基質であるペプチドを介し、シグナルをクエンチさせるGd錯体で修飾した。市販のカテプシンKとの酵素反応を行い、19FMRIシグナルを測定したところ、酵素反応に応じてシグナルの上昇が見られた。また、このプローブは他のカテプシン類であるカテプシンB、S、Lではほとんど応答せず、カテプシンKに対し高い特異性を持っていることが示された。
破骨細胞を長時間観察できる赤色蛍光プローブの開発を行った。これまでに開発した緑色蛍光プローブでは緑色蛍光タンパク質でラベルされたマウスには波長領域の重複により使用ができない。そこで赤色領域に蛍光波長を有するローダミン色素を母骨格としたpH応答性色素の開発に着手した。破骨細胞は活性化時に酸を放出し、その領域でのpHは4.5～6.0と言われている。この領域で蛍光を発するようにローダミン色素構造の改変を行った。特に、ローダミンのスピロ環化反応に着目し、中性では閉環しているが、弱酸性条件で開環し蛍光を発するように色素構造の置換基を検討した結果、トリフルオロエチル基を導入したものが優れたpH応答性を示した。加えて、開環の際の速度にも置換基効果が現れることを見出した。
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| Strategy for Future Research Activity |
in vivoで酵素活性を検出する19FMRIプローブの開発：19FMRIプローブに関しては、これまでの酵素活性検出型プローブの設計で得られた知見を活かし、アポトーシス時に発現が亢進するカスパーゼ-3を標的としたプローブを開発する。これまで開発してきたナノ粒子型プローブであるFLAMEの表面をカスパーゼ-3基質であるペプチドを介し、シグナルをクエンチさせるGd錯体で修飾する。得られたプローブの酵素反応後の19FMRIシグナルの変化が大きくなるよう、基質配列の検討を行う。最終的にプローブをマウス体内に投与後、アポトーシス誘導を行い、19FMRIによるシグナル検出を試みる。これらの実験により、抗がん剤投与によって生体内でアポトーシスが引き起こされる過程をin vivoイメージングにより可視化する。
破骨細胞を長時間観察できる蛍光プローブの開発：破骨細胞検出プローブに関しては、前年度の赤色領域に蛍光を示す色素の検討により、赤色領破骨細胞活性を検出できるpH領域で応答するようなローダミン色素を合成することに成功した。本年度はこの色素にビスフォスフォネート基を導入し、骨組織への送達を可能にしたプローブを開発する。加えて、構造として類似しているがpH応答性のない蛍光プローブも設計・合成し比較対照実験を行う。開発したプローブをマウスに投与し長時間イメージングを行うことで、緑色蛍光タンパク質でラベルした破骨細胞内のプロトンポンプと赤色蛍光プローブが示す酸性領域との位置情報の相関、その動的な変化を解析する。
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[Journal Article] Fabrication of ‘Clickable’ Polyfluorene Nanowires with High Aspect Ratio as Biological Sensing Platforms2016
Author(s)
T. Wasin, K. Enomoto, T. Sakurai, V. Padalkar, H. Cheng, M. Tang, A. Horio, D., Sakamaki, M. Omichi, A. Saeki, K. Kikuchi, Y. Hori, A. Chiba, Y. Saito, T. Kamiya, M. Sugimoto, S. Seki
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Journal Title
ACS Sensors
Volume: 6
Pages: 766-774
DOI
Peer Reviewed
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