2013 Fiscal Year Annual Research Report
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25221004
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Grant-in-Aid for Scientific Research (S)
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
上田 泰己 東京大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (20373277)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田井中 一貴 東京大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (80506113)
大出 晃士 東京大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (40612122)
洲崎 悦生 東京大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (10444803)
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| Project Period (FY) |
2013-05-31 – 2018-03-31
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| Keywords | 概日振動 / リン酸化 / 温度補償性 / 自律発振機構 / 変異マウス作成 |
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| Research Abstract |
本研究課題では、未だに解明されていない哺乳類概日時計の持つ温度補償性の分子機構の理解を目標に掲げている。具体的には、試験管内で再現されたCKIε/δによるPER2ペプチドのリン酸化過程の温度補償性を解析し、温度補償性を生み出す基質と酵素を設計可能な程まで理解すること、また、温度補償性を制御する化合物を設計し、概日周期の温度補償性の制御を可能とすることを課題の一つとして設定している。
CKIε/δによるPER2ペプチドのリン酸化過程は温度補償性が保たれているものの、複雑な多段階反応が生じるため、PER2ペプチドそのものを用いて温度補償性の分子機構を解明するのは困難である。当該年度において我々は、リン酸化ペプチドの量比を経時的かつハイスループットに解析可能なモビリティーシフトアッセイを用いて、温度補償性が担保されている、より単純なペプチドモデル系の探索を行った。その結果、興味深いことにリン酸化部位をわずか１箇所しか含まないにも関わらず温度に依存しないリン酸化反応を示すペプチドモチーフを見出した。
また、概日周期の頑強な温度補償性がCKIδのリン酸化過程に由来すると仮定すると、CKIδに温度補償性を生み出す機能が内在的に備わっているはずである。そこで、一連のCKIδの変異体を網羅的に作製し、試験管内においてリン酸化活性を評価したところ、変異導入によりCKIδのリン酸化活性の温度依存性が著明に変化するアミノ酸部位を同定した。
更に、ハイスループットなモビリティーシフトアッセイを用いてLOPACのケミカルライブラリからリン酸化活性に対する薬剤のケミカルスクリーニングを行った結果、CKIδのリン酸化反応の逆反応を効率的に阻害するリード化合物を発見した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本研究課題において、生化学反応のリン酸化反応に温度補償性があることは、１）温度上昇に伴う酵素と基質の親和性の低下、もしくは逆反応速度の亢進による補償機構、２）共有結合の切断を伴わない酵素・基質の結合解離などの温度に依存しにくい過程が律速である温度非依存機構、のいずれかを示唆していることを提案している。これらの仮説を検証するためには、多段階に及ぶリン酸化過程を単純化し、酵素と基質の間の親和性や結合・解離速度、逆反応の有無、及び正反応・逆反応の温度依存性等を緻密に定量可能な評価系を構築しなければならない。
当該年度において、我々はリン酸化部位をわずか１箇所しか含まないにも関わらず温度に依存しないリン酸化反応を示す、極めて単純なペプチドモチーフを見出すことに成功した。このことから、当初の計画通り、NMRによる酵素・基質の複合体構造解析や、等温滴定型熱量計、表面プラズモン共鳴センサー、1分子蛍光分析システムによる分子間相互作用解析を通じて、温度補償性の分子機構を精密に評価する基盤が整った。また、CKIδ変異体のリン酸化活性評価から、温度補償性に寄与する一連のアミノ酸残基の同定に成功した。従って、次年度以降の研究目標として定めていた『温度補償性を有する基質・酵素が設計可能な程まで設計原理を理解する』ために必要な基礎的知見は既に得られた。
更に、ハイスループットなモビリティーシフトアッセイによるケミカルスクリーニングを通じて、CKIδのリン酸化反応の逆反応を効率的に阻害するリード化合物を発見した。従って、次年度以降の研究目標として定めていた『振動周期を加速する』候補分子の探索に成功しており、『概日振動の制御』のために必要な基盤が整いつつある。
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| Strategy for Future Research Activity |
単純化したリン酸化モデルペプチドの発見、及びCKIδにおいて温度補償性に寄与する一連のアミノ酸残基の同定に成功したことから、温度補償性の分子機構を解析する基盤が整っている。次年度は、これらの知見を元に１）温度上昇に伴う酵素と基質の親和性の低下、もしくは逆反応速度の亢進による補償機構、２）共有結合の切断を伴わない酵素・基質の結合解離などの温度に依存しにくい過程が律速である温度非依存機構、の二つの仮説を検証し、リン酸化反応において温度補償性を生み出す分子機構の解明に取り組む。具体的には、NMRによるCKIδと基質ペプチドの複合体の構造解析、及び、等温滴定型熱量計（ITC）、表面プラズモン共鳴センサー（Biacoreシステム）、1分子蛍光分析システム（MF-20）を用いた定量的かつ動力学的な分子間相互作用解析を行うことで、酵素と基質の間の親和性や結合・解離速度、逆反応の有無、及び正反応・逆反応の温度依存性を定量する。
また、試験管内で再構成された温度非依存的なリン酸化反応が、細胞レベルで概日時計の温度補償性に寄与していることを検証するために、CKIδを細胞内で過剰発現させ、Periodタンパク質の安定性に対する温度依存性を評価する。更に、CKIε/δもしくはPer1/2ダブルノックアウト細胞にCKIε/δやPer1/2発現プラスミドを一過的に導入し概日周期を再現するノックアウト細胞レスキュー系の構築に取り組み、試験管内で予想される表現型が得られるかを評価する。
更に、上記で見出された動作原理の生物学的・医学的意義を検証するために、ノックアウトマウスレスキュー系を用いた個体レベルでの仮説検証に向けた準備を進める。
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Research Products
(17 results)
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[Journal Article] Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis2014
Author(s)
Etsuo A. Susaki, Kazuki Tainaka, Dimitri Perrin, Fumiaki Kishino, Takehiro Tawara, Tomonobu Watanabe, Chihiro Yokoyama, Hirotaka Onoe, Megumi Eguchi, Shun Yamaguchi, Takaya Abe, Hiroshi Kiyonari, Yoshihiro Shimizu, Atsushi Miyawaki, Takeshi Imai, Hideo Yokota and Hiroki R. Ueda.
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Journal Title
Cell
Volume: 157
Pages: 726;739
DOI
Peer Reviewed
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[Presentation] 『時間』の生命科学2013
Author(s)
上田泰己
Organizer
大阪医科大学 内科学I 紫水会 特別講演
Place of Presentation
大阪医科大学（大阪）
Year and Date
20131117-20131117
Invited
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