2014 Fiscal Year Annual Research Report
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25221004
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
上田 泰己 東京大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (20373277)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
洲崎 悦生 東京大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (10444803)
大出 晃士 東京大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (40612122)
田井中 一貴 東京大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (80506113)
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| Project Period (FY) |
2013-05-31 – 2018-03-31
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| Keywords | 概日振動 / リン酸化 / 温度補償性 / 自律発振機構 / 変異マウス作製 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題では、未だに解明されていない哺乳類概日時計の持つ温度補償性の分子機構の理解を目標に掲げている。具体的には、試験管内で再現されたCKIε/δによるPER2ペプチドのリン酸化過程の温度補償性を解析し、温度補償性を生み出す基質と酵素を設計可能な程まで理解することを課題の一つとして設定している。これまでに我々はリン酸化部位を１箇所のみ含み、かつ温度に依存しないリン酸化反応を示す基質ペプチドモチーフを発見した。また、変異導入によりCKIδのリン酸化活性の温度依存性が著明に変化するアミノ酸部位を同定し、温度補償性が欠損するCKIδ変異体を見出した。更には、CKIδのリン酸化反応の逆反応を効率的に阻害するリード化合物を発見した。当該年度において我々は、これらの知見に基づき、CKIδによるリン酸化反応における温度非依存性の起源となる分子機構の解明に取り組んだ。等温滴定型熱量計（ITC）、表面プラズモン共鳴センサー（Biacoreシステム）、1分子蛍光分析システム（MF-20）を用いて定量的かつ動力学的な分子間相互作用解析を行った結果、基質ペプチドモチーフのリン酸化産物とCKIδが安定な複合体を形成するだけでなく、温度が高い程その親和性が向上することを明らかにした。一方、試験管内ケミカルスクリーニングによって発見されたリン酸化反応の温度非依存性が欠損したCKIδ変異体は、リン酸化産物と複合体を形成しなかった。更に、CKIδのリン酸化反応の逆反応を阻害するリード化合物がどのような機序で作用しているかを検証するために、CKIδと化合物のin silicoドッキングシミュレーションを行った結果、化合物の酵素に対する標的部位が温度補償性に寄与するアミノ酸残基周辺であることが示された、以上から、酵素の生成物結合がリン酸化反応の温度非依存性の起源である可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本研究課題において、生化学反応のリン酸化反応に温度補償性があることは、１）温度上昇に伴う酵素と基質の親和性の低下、もしくは逆反応速度の亢進による補償機構、２）共有結合の切断を伴わない酵素・基質の結合解離などの温度に依存しにくい過程が律速である温度非依存機構、のいずれかを示唆している。これらの仮説を検証するためには、多段階に及ぶリン酸化過程を単純化し、酵素と基質の間の親和性や結合・解離速度、逆反応の有無、及び正反応・逆反応の温度依存性等を緻密に定量可能な評価系を構築しなければならない。
これまでに、我々はリン酸化部位を１箇所のみ含み、かつCKIδにより温度に依存しないリン酸化反応を示す基質ペプチドモチーフを発見することで、多段階に及ぶリン酸化過程の単純化に成功しており、温度補償性の分子機構を精密に評価する基盤が整っていた。当該年度において、我々は等温滴定型熱量計、表面プラズモン共鳴センサー、1分子蛍光分析システムによる分子間相互作用解析の評価系構築に成功した。その結果、基質ペプチドモチーフのリン酸化産物とCKIδが安定な複合体を形成し、温度が上昇する程その親和性が向上することを明らかにした。また、温度補償性が欠損した一連のCKIδ変異体では、リン酸化産物と複合体を形成しなかったことから、酵素の生成物結合と温度非依存的なリン酸化反応の相関が示唆された。更には、in silicoドッキングシミュレーションの結果、CKIδのリン酸化反応の逆反応を阻害するリード化合物が温度補償性に寄与するアミノ酸残基周辺に作用することが示された。以上を総合すると、酵素の生成物結合がリン酸化反応の温度補償性の起源である可能性が示唆された。従って、本研究課題における研究目標となる『温度補償性を有する基質・酵素が設計可能な程まで設計原理を理解する』ための有力な仮説が得られた。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）基質ペプチドモチーフのリン酸化産物とCKIδが安定な複合体を形成するだけでなく、温度が高い程その親和性が向上すること、２）リン酸化反応の温度補償性が欠損したCKIδ変異体は、リン酸化産物と複合体を形成しないこと、３）CKIδのリン酸化反応の逆反応を阻害するリード化合物が温度補償性を欠損させるアミノ酸残基周辺に作用していることから、酵素の生成物結合がリン酸化反応における温度補償性の起源である可能性が示唆された。
本年度は、酵素の生成物結合が温度補償性の起源であることを実証するために、CKIδと基質ペプチドのリン酸化反応における数理モデルを構築し、観測された生成物結合の親和性がどの程度リン酸化反応の温度補償性に寄与しているかを検証する。特に、基質結合から生成物解離までの反応過程に加えて、反応系で他に生じうる反応パラメーターを包括的に解析し、理論・実験の両方で矛盾のない反応機構の理解に取り組む。
また、試験管内で再構成された温度非依存的なリン酸化反応が、細胞レベルで概日時計の温度補償性に寄与していることを検証するために、CKIδを細胞内で過剰発現させ、Periodタンパク質の安定性に対する温度依存性を評価する。更に、CKIε/δもしくはPer1/2ダブルノックアウト細胞にCKIε/δやPer1/2発現プラスミドを一過的に導入し概日周期を再現するノックアウト細胞レスキュー系の構築に取り組み、試験管内で予想される表現型が得られるかを評価する。
最後に、ノックアウトマウスレスキュー系を用いた組織・個体レベルでの仮説検証に向けた準備を進める。試験管内において温度補償性が欠損するCKIδ変異体についてレスキューカセットを作製・ゲノム導入し、個体の行動表現型解析、及び体内時計の中枢組織である視交叉上核(SCN)スライスにおけるレポーターアッセイを通じて、上述の仮説を検証する。
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[Journal Article] Whole-Brain Imaging with Single-Cell Resolution Using Chemical Cocktails and Computational Analysis2014
Author(s)
Etsuo A. Susaki, Kazuki Tainaka, Dimitri Perrin, Fumiaki Kishino, Takehiro Tawara, Tomonobu M. Watanabe, Chihiro Yokoyama, Hirotaka Onoe, Megumi Eguchi, Shun Yamaguchi, Takaya Abe, Hiroshi Kiyonari, Yoshihiro Shimizu, Atsushi Miyawaki, Hideo Yokota, and Hiroki R. Ueda
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Journal Title
Cell
Volume: 157
Pages: 726-739
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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