2013 Fiscal Year Annual Research Report
昆虫―大腸菌人工共生系による共生進化および分子機構の解明
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25221107
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Grant-in-Aid for Scientific Research (S)
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| Research Institution | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology |
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Principal Investigator |
深津 武馬 独立行政法人産業技術総合研究所, 生物プロセス研究部門, 首席研究員 (00357881)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
古賀 隆一 独立行政法人産業技術総合研究所, 生物プロセス研究部門, 主任研究員 (80356972)
二河 成男 放送大学, 教養学部, 教授 (70364916)
中島 裕美子 琉球大学, 熱帯生物圏研究センター, 准教授 (70244340)
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| Project Period (FY) |
2013-05-31 – 2018-03-31
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| Keywords | 昆虫 / チャバネアオカメムシ / 腸内共生細菌 / 大腸菌 / 実験進化 / ゲノム解析 / 分子機構 |
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| Research Abstract |
・6種共生細菌ゲノムの完全塩基配列決定：共生細菌Cの4.3Mbのゲノムおよび0.73M，0.5，0.2Mの3つのプラスミドから成る全ゲノム配列を決定した。共生細菌AとCのゲノムを比較すると、遺伝子の塩基配列にそれほど大きな差はないものの、挿入配列の単純化と増加、遺伝子順序（シンテニー）の変化に非常に大きな差があることがわかった．他の５種の共生細菌ゲノムの決定も最終段階にある。
・共生細菌の形質転換系、遺伝子破壊系の確立：培養できる共生細菌C, D, E, Fについてトランスポゾン挿入によるGFP発現系統を確立した。
・共生細菌フォスミドライブラリー導入大腸菌のスクリーニングによる共生関連遺伝子候補の網羅的取得：共生細菌Cのフォスミドライブラリーを作成し、シーケンシングで挿入領域を特定したクローンを200以上取得し、スクリーニングを開始した。
・チャバネアオカメムシに人工共生させた大腸菌の継続的な飼育維持、選抜による実験共生進化解析：次世代シーケンサーによる配列決定技術の急速な進捗及びゲノム進化の加速効果を鑑み、大腸菌系統としてK－12由来のBW25113を使用することにし、ΔmutS突然変異体もBW25113から作成した。BW25113を用いて一連の予備実験を行い，1）細菌の獲得量は接種源となる培養液の濃度に比例し、0.1ODの接種源で3000個程度の細菌を獲得する、2）この条件で大腸菌を獲得させた個体は成虫時におよそ108個の大腸菌を保有している、3）この大腸菌の量は培養を経ずに次世代の接種を行うに十分な量である；等を確認したうえで、本実験を1）体色（より緑色を示すもの），2）成長速度（羽化日数が短いもの），3）体サイズ（胸部幅が広いもの），4）総合力（体色，体サイズ，共生器官の発達具合の3項目の成績が最も良好なもの）の4つの選択基準をもとに開始した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
・6種共生細菌ゲノムの完全塩基配列決定：共生細菌Cのゲノムの完全決定した一方で、他の５種については完全決定がまだである点に予定より若干の遅れがみられるが、それらもすべて最終段階に入っており、平成26年度中にすべて完全決定の予定である。
・共生細菌の形質転換系、遺伝子破壊系の確立：トランスポゾンによる遺伝子導入系を確立し、順調に進捗している。
・共生細菌フォスミドライブラリー導入大腸菌のスクリーニングによる共生関連遺伝子候補の網羅的取得：共生細菌Cのフォスミドライブラリーの構築、形質転換大腸菌の宿主カメムシへの感染および表現型スクリーニングが順調に進捗している。
・チャバネアオカメムシに人工共生させた大腸菌の継続的な飼育維持、選抜による実験共生進化解析：基本的な飼育実験系および表現型スクリーニング系の立ち上げを完了し、野生型大腸菌について実験を開始し、ΔmutS大腸菌系統も作成済みであり、順調に進捗している。
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| Strategy for Future Research Activity |
・6種共生細菌ゲノムの完全塩基配列決定について、共生細菌A, B, D, E, Fのゲノムを完全決定する。
・共生細菌の形質転換系、遺伝子破壊系の確立について、相同組換え等による遺伝子破壊系を確立する。
・共生細菌フォスミドライブラリー導入大腸菌のスクリーニングによる共生関連遺伝子候補の網羅的取得について、共生細菌Cについて徹底的に進め、ゲノム上の共生関連遺伝子候補を網羅的に取得する。
・共生関連遺伝子の同定および機能解析について、上で得られたフォスミドクローン上の遺伝子群について、共生関連遺伝子の同定および機能解析を進める。
・チャバネアオカメムシに人工共生させた大腸菌の継続的な飼育維持、選抜による実験共生進化解析については、野生型大腸菌およびΔmutS大腸菌系統について共生進化実験を本格的に遂行する。
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