人工多能性幹細胞由来がん幹細胞モデルを利用する根本的がん治療薬の開発

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 25242045
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 妹尾 昌治 岡山大学, 自然科学研究科, 教授 (90243493)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 笠井 智成 岡山大学, 自然科学研究科, 講師 (30530191) ; 工藤 孝幸 岡山大学, 自然科学研究科, 助教 (00346412) ; 水谷 昭文 岡山大学, 自然科学研究科, 助教 (50598331) ; 日沼 州司 千里金蘭大学, 生活科学部, 教授 (60550522) ; 加来田 博貴 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 准教授 (80362961) ; 村上 宏 岡山大学, 自然科学研究科, 准教授 (90260174)
• Project Period (FY): 2013-10-21 – 2017-03-31
• Keywords: iPS細胞 / がん幹細胞 / 制がん剤

Outline of Annual Research Achievements

1.幹細胞からがん幹細胞を誘導する因子の同定：Notch活性化因子の同定を目的として、miPS-LLCcm細胞の培養上清（CM）に対するexosome画分の除去、加熱処理、限外ろ過処理を行い、がん幹細胞の自己複製（スフェロイド形成）を指標として活性化因子の含まれる画分を限定した。その結果、miPS-LLCcmの自己複製に関与するNotch活性化因子は、熱耐性であり、10kDa以下の分子量であることが見出された。
2.がんワクチンの調整：siRNAの放出を調節する分子があるかどうかについて検討した結果、香辛料のターメリック由来のポリフェノールであるクルクミンが、siRNA内包DOPC/DOPEリポソームに作用して、siRNAの放出を強力に促進することがわかった。また、クルクミンのような物質は、特定の脂質組成のリポソーム膜に作用して、内包物であるsiRNAを放出促進させる作用があることがわかり、クルクミンのような分子はsiRNA内包リポソームからsiRNAを放出させるための分子スイッチのモデルとして利用できる可能があることを明らかにした。
3.がん幹細胞分化誘導因子の同定：ヒトがん細胞株の培養上清を回収して、限外濾過することで分画した。各画分による分化誘導の効果を評価することで、因子の探索を行った。
4.既存抗がん剤効果の検討：各種ニトロアルケン、α-アミノ酸エステルを用いて新規合成法の基質適用限界を調査した結果、様々なニトロアルケン、α-アミノ酸エステルが利用可能であるが、水溶性の高い官能基を有するα-アミノ酸エステルを用いた場合、収率が低下する傾向があることが明らかとなった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

幹細胞からがん幹細胞を誘導する因子の同定を目的として、Notchの活性化因子を同定するために、miPS-LLCcm細胞の培養上清（CM）に含まれるexosome画分の除去、加熱処理、限外ろ過処理を行った。こ野結果、がん幹細胞の自己複製（スフェロイド形成）を活性化する因子が含まれる画分を調製することができた。これにより、miPS-LLCcmの自己複製に関与するNotch活性化因子は、熱耐性であり、10kDa以下の分子量であると推定されたことで、さらに具体的な因子を同定するための情報を絞り込めることが期待できるようになった。
リポソーム化したsiRNAの放出を調節する分子があるかどうかについて検討した結果、香辛料のターメリック由来のポリフェノールであるクルクミンが、siRNA内包DOPC/DOPEリポソームに作用して、siRNAの放出を強力に促進することがわかった。また、クルクミンのような物質は、特定の脂質組成のリポソーム膜に作用して、内包物であるsiRNAを放出促進させる作用があることがわかり、siRNA内包リポソームからsiRNAを放出させるための分子スイッチのモデルとして利用できる可能があることを明らかにした。このことはがん細胞やがん幹細胞から放出されるエクソソームに内包されるmRNAの同定に利用できる可能性があり、これらに対して中和活性を持つ分子をがんワクチンとして調製できる可能性が示され多と考える事ができる。
さらに、がん幹細胞に効果を示す既存抗がん剤を検討する目的で、各種ニトロアルケン、α-アミノ酸エステルを用いて新規合成法の基質適用限界を調査し、解決すべき課題はあるものの、様々なニトロアルケン、α-アミノ酸エステルが利用可能であることが分かった。

Strategy for Future Research Activity

１．幹細胞からがん幹細胞を誘導する因子の同定：miPS-LLCcmの培養上清をさらに分画を行い、特異的な成分候補を見出していく。ペプチド等を分離し、Notch活性化能の有無を検証する。
２．がん幹細胞に対する増殖抑制剤の開発：クルクミンのsiRNA内包化リポソームに対する作用について精査し、任意にsiRNAを放出させることができるようなリポソームを作製し、最終的には、iPS由来がん幹細胞の抑制に有効なsiRNA内包化リポソームの作製方法を確立する。
３．がん幹細胞分化誘導因子の解析と評価：本年度は、がん細胞の培養上清から得たがん幹細胞誘導化活性が高い画分を用いて、 幹細胞を誘導する因子の同定を試みる。さらに、がん幹細胞マーカーの一つであるCD44を標的するリポソームの開発を行う。また、がん幹細胞マーカー分子を探索すると共に、このマーカーを標的する分子デザインを検討する。
４．がん幹細胞複製抑制化合物の探索：サラゾスルファピリジン（SASP）誘導体について、iPS誘導がん幹細胞モデルに対する細胞増殖抑制または分化誘導に対する評価を実施する。さらに、ピペラジノン化合物ライブラリーの構築のため、ピペラジノン化合物の合成を完了する。また、新たな取り組みとして、がん細胞にのみ選択的に細胞毒性、増殖阻害活性を示す天然物である Flavagline 類に着目して新規分子設計を行う。

Research Products

• [Journal Article] Bacteria: prospective savior in battle against cancer. (2014)
  • Author(s): Nair N, Kasai T, Seno M.
  • Journal Title: Anticancer Research Volume: 11 Pages: 6289-96
  • DOI: 10.7150/jca.8865
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Efficient drug delivery of Paclitaxel glycoside: a novel solubility gradient encapsulation into liposomes coupled with immunoliposomes preparation. (2014)
  • Author(s): Shigehiro T, Kasai T, Murakami M, Sekhar SC, Tominaga Y, Okada M, Kudoh T, Mizutani A, Murakami H, Salomon DS, Mikuni K, Mandai T, Hamada H, Seno M
  • Journal Title: PLoS One Volume: 9 Pages: e107976
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0107976
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Characterization of cancer stem-like cells derived from mouse induced pluripotent stem cells transformed by tumor-derived extracellular vesicles. (2014)
  • Author(s): Yan T, Mizutani A, Chen L, Takaki M, Hiramoto Y, Matsuda S, Shigehiro T, Kasai T, Kudoh T, Murakami H, Masuda J, Hendrix MJ, Strizzi L, Salomon DS, Fu L, Seno M.
  • Journal Title: Journal of Cancer Volume: 7 Pages: 572-584
  • DOI: 10.7150/jca.8865
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] In vitro anti-proliferative and anti-angiogenic activities of thalidomide dithiocarbamate analogs. (2014)
  • Author(s): El-Aarag BY, Kasai T, Zahran MA, Zakhary NI, Shigehiro T, Sekhar SC, Agwa HS, Mizutani A, Murakami H, Kakuta H, Seno M.
  • Journal Title: International Immunopharmacology Volume: 2 Pages: 283-92
  • DOI: 10.1016/j.intimp.2014.05.007
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Cancer stem cells converted from pluripotent stem cells and the cancerous niche. (2014)
  • Author(s): Kasai T, Chen L, Mizutani A, Kudoh T, Murakami H, Fu L, Seno M
  • Journal Title: Journal of Stem Cells & Regenerative Medicine Volume: 1 Pages: 2-7
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Chlorotoxin-Fc fusion inhibits release of MMP-2 from pancreatic cancer cells. (2014)
  • Author(s): El-Ghlban S, Kasai T, Shigehiro T, Yin HX, Sekhar S, Ida M, Sanchez A, Mizutani A, Kudoh T, Murakami H, Seno M.
  • Journal Title: Biomed Research International Volume: - Pages: 152659
  • DOI: 10.1155/2014/152659
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Mouse induced pluripotent stem cell microenvironment generates epithelial-mesenchymal transition in mouse Lewis lung cancer cells. (2014)
  • Author(s): Chen L, Mizutani A, Kasai T, Yan T, Jin G, Vaidyanath A, El-Aarag BY, Liu Y, Kudoh T, Salomon DS, Fu L, Seno M.
  • Journal Title: American Journal of Cancer Research Volume: 1 Pages: 80-8
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Development of 111In-labeled liposomes for vulnerable atherosclerotic plaque imaging. (2014)
  • Author(s): Ogawa M, Umeda IO, Kosugi M, Kawai A, Hamaya Y, Takashima M, Yin H, Kudoh T, Seno M, Magata Y.
  • Journal Title: Journal of Nuclear Medicine Volume: 1 Pages: 115-20
  • DOI: 10.2967/jnumed.113.123158
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Cancer stem cells maintain a hierarchy of differentiation by creating their niche. (2014)
  • Author(s): Matsuda S, Yan T, Mizutani A, Sota T, Hiramoto Y, Prieto-Vila M, Chen L, Satoh A, Kudoh T, Kasai T, Murakami H, Fu L, Salomon DS, Seno M.
  • Journal Title: International Journal of Cancer Volume: 1 Pages: 27-36
  • DOI: 10.1002/ijc.28648
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] ニトロアルケンへのα-アミノ酸エステルのマイケル付加を鍵反応とする置換ピペラジノン合成法の応用 (2015)
  • Author(s): 鍵本祥子、工藤孝幸、坂倉彰
  • Organizer: 第９５回日本化学会春季年会
  • Place of Presentation: 船橋
  • Year and Date: 2015-03-26 – 2015-03-29
• [Presentation] がん幹細胞ニッチにおけるがん幹細胞の自己複製制御機構の解析 (2014)
  • Author(s): 平本祐樹、渡邉直哉、松田修一、Yan T、Marta P Vila、水谷昭文、村上宏、笠井智成、妹尾昌治
  • Organizer: 第37 回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 横浜
  • Year and Date: 2014-11-25 – 2014-11-27
• [Presentation] Tumor derived exosome/microvesicles convert mouse iPS cells to cancer stem-like cells (2014)
  • Author(s): Yan T, Mizutani A, Chen L, Murakami H, Seno M
  • Organizer: 第37 回日本癌学会学術総会
  • Place of Presentation: 横浜
  • Year and Date: 2014-09-25 – 2014-09-27
• [Presentation] ヒトiPS 細胞から作るがん幹細胞 (2014)
  • Author(s): 笠井智成、水谷昭文、工藤孝幸、佐藤あやの、陳凌、妹尾昌治
  • Organizer: 第37 回日本癌学会学術総会
  • Place of Presentation: 横浜
  • Year and Date: 2014-09-25 – 2014-09-27
• [Presentation] Tumor derived exosomes/microvesicles convert mouse induced pluripotent stem cells to cancer stem cells (2014)
  • Author(s): Yan T, Mizutani A, Chen L, Murakami H, Seno M
  • Organizer: Exosomes & Single cell Analysis Summit
  • Place of Presentation: サンディエゴ アメリカ
  • Year and Date: 2014-09-18 – 2014-09-19
• [Presentation] iPS 細胞から作るがん幹細胞ライブラリー-抗がん剤スクリーニングプラットフォームとして- (2014)
  • Author(s): 笠井智成、本庶仁子、公文一輝、星川健太、竹尻崇人、朝倉真実、水谷昭文、村上宏、妹尾昌治
  • Organizer: 化学療法基盤支援活動第3 回シンポジウム
  • Place of Presentation: 沖縄
  • Year and Date: 2014-05-12 – 2014-05-12
• [Presentation] Cancer stem cells maintain a hierarchy of differentiation by creating their niche (2014)
  • Author(s): Mizutani A, Matsuda S, Yan T, Prieto-Vila M, Chen L, Satoh A, Kasai T, Masuda J, Kudoh T, Murakami H, Fu L, Salomon DS, Seno M
  • Organizer: AACR Annual meeting 2014
  • Place of Presentation: サンディエゴ アメリカ
  • Year and Date: 2014-04-05 – 2014-04-09
• [Presentation] Characterization of cancer stem-like cells derived from mouse induced pluripotent stem cells transformed by tumor-derived exosomes/microvesicles (2014)
  • Author(s): Yan T, Masuda J, Mizutani A, Chen L, Shigehiro T, Matsuda S, Kasai T, Kudoh T, Murakami H, Hendrix MJ, Strizzi L, Salomon DS, Seno M
  • Organizer: AACR Annual meeting 2014
  • Place of Presentation: サンディエゴ アメリカ
  • Year and Date: 2014-04-05 – 2014-04-09