2013 Fiscal Year Annual Research Report
ステム構造を必要としない高感度リニアプローブの創成
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25248037
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
浅沼 浩之 名古屋大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (20282577)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
神谷 由紀子 名古屋大学, エコトピア科学研究所, 講師 (00527947)
樫田 啓 名古屋大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (30452189)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | ペリレン / 蛍光プローブ / リニアプローブ / アントラキノン / インベーダー / mRNA |
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| Research Abstract |
２５年度は、高いシグナル/バックグラウンド（S/B）比を維持しつつ二重鎖を不安定化させないリニアプローブを設計した。蛍光色素としてペリレンの誘導体を様々検討した結果、電子吸引性基であるエチニル基を導入したペリレンが、二重鎖の不安定化を伴わずにリニアプローブの高感度化が可能なことが分かった。また対応する天然のDNAと比較しても融解温度の低下はほとんどなかった。次に更なる高感度化を目指し、消光色素との併用を検討した。これまでの研究からペリレンの消光剤としてはアントラキノンが優れていることが分かっていたので、アントラキノンを末端近傍に導入し、ペリレンをDNA内部に多数導入したリニアプローブを設計した。電子吸引性のアントラキノンはスタッキングン相互作用により二重鎖を大きく安定化することが期待できるので、アントラキノンとの併用はS/B比の飛躍的な向上と、ターゲットDNAおよびRNAとの大きな安定化が期待できる。事実最適化したプローブは、ターゲットRNA認識に伴うS/B比が1500という超高感度を実現した。また最適化したリニアプローブはDNAおよびRNAと極めて安定な二重鎖を形成した。さらにリニアプローブは十分な酵素耐性を有しており、HeLa細胞抽出液とインキュベートしてもほとんど分解されないことも判明した。
上記の結果を基に、ストランドインベーダーとして機能するリニアプローブを設計した。アントラキノンをDNA鎖の中央部に多数導入し、末端近傍にエチニルペリレンを導入したリニアプローブを合成したところ、相補的なDNAとは極めて安定な二重鎖を形成するがPNAとは安定な二重鎖形成しないことが判明した。すなわち新たに設計したリニアプローブは、ストランドインベージョンの条件を満たしていることが判明した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
２５年度はリニアプローブの高感度化と、ストランドインベージョンの条件を満たすリニアプローブの設計をめざし、その両方を実現した。特筆すべきは、最適化したリニアプローブのS/B比は1500にも達した点であり、これは従来型のモレキュラービーコンでも実現不可能な超高感度である。さらに十分な酵素耐性も有していることが判明し、細胞内で分解されることなくm-RNAを蛍光イメージングする目途が立った。
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| Strategy for Future Research Activity |
25年度に予想を超える成果が得られたので、今年度は予定を前倒しして、１）リニアプローブによる細胞内でのmRNAの蛍光モニタリング、２）ストランドインベージョンによる二重鎖DNAの蛍光ラベル を検討する。
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[Presentation] Development of Modified siRNA for Improvement of RNAi Activity and Monitoring in Cells2013
Author(s)
Yukiko Kamiya, Junya Takai, Masaaki Urushihara, Hiroshi Ito, Xingguo Liang, Anna Ito, Kenji Yoshida, Taiga Fujii, Hiromu Kashida, Hiroyuki Asanuma
Organizer
62nd SPSJ Annual Meeting,
Place of Presentation
Kyoto
Year and Date
20130529-20130531
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