2015 Fiscal Year Annual Research Report
Principles for assembling cascade enzymes
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25248038
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
森井 孝 京都大学, エネルギー理工学研究所, 教授 (90222348)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | DNAナノ構造体 / 代謝反応 / 酵素反応 / 多段階反応 / 分子コンビナート |
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| Outline of Annual Research Achievements |
生体内の代謝反応では、連続する代謝反応に関連する酵素が、空間的に近接した配置を取ることによって、効率よく多段階の代謝反応が進行すると考えられている。さらに、細胞膜上では特定の基質に結合する受容体(リセプター)の集積化がシグナル伝達の制御に関わっていることが示唆されている。DNAオリガミは、DNAが特定の組み合わせで塩基対を形成する性質を利用して作製されるナノ構造体である。多彩な形状のDNAオリガミを容易に設計・作製することができ、その上に様々な生体高分子を位置特異的に配置することができる。従って、酵素やリセプターをナノメートルの精度で、厳密に数や距離を制御した集積体のした場合の基質親和性、基質選択性、反応速度などを実験的に明らかにすることが可能になる。
RevペプチドとRev Response Element (RRE) RNAの複合体を基本骨格とし、様々な基質に対するリセプター、蛍光性RNPセンサーが作製できる。さらに、RNPは容易にDNAオリガミ上の特定の位置に配置出来るこれらの方法論を拡張して、基質結合場に触媒基を隣接させることにより、触媒活性を発揮するRNP酵素を作製した。ATP結合性RNPをもとにして作製した、触媒基を有するRNPライブラリーをATP誘導体エステルの加水分解活性を指標としてスクリーニングし、エステル加水分解活性を有するRNP酵素を得た。集積化した状態での受容体の挙動を明らかにするためには、受容体との結合挙動が光学的シグナルによって検出できる蛍光性受容体を用いる必要がある。そのため、蛍光分子ライブラリーを利用して、RNPリセプターを蛍光センサーへと変換する方法論を開発した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
（1）複数種の酵素を配置した多段階変換反応の効率化
RNPはDNAオリガミ上に容易に配置できる。この特長を活かすために、基質結合場に触媒基を隣接させることにより、触媒活性を発揮するRNP酵素を作製した。RNPリセプターをもとにして、触媒活性を発揮するRNPを得るためのRNPライブラリーを作製した。基質結合場の近傍に触媒分子を配置することにより、近接効果によって反応が加速される可能性がある。そこで、近接効果を発現できるような三次元構造をもつRNPを獲得するため、「多様な立体構造をもつRNPライブラリー」を構築した。構造多様性を持つATP結合性RNPリセプターのRNAサブユニットライブラリーと、触媒分子を様々な構造モチーフを介してペプチドサブユニットのN末端に導入したペプチドライブラリーを組み合わせて、600種類以上の構造多様性に富んだ「触媒分子導入RNPリセプターライブラリー」を構築した。このRNPライブラリーから、標的反応に対する触媒活性を示すRNPを選択した。簡便かつ迅速に、触媒活性を指標としたRNPのスクリーニングを行うために、加水分解反応により蛍光特性が変化するウンベリフェリルエステルを有するATP誘導体を基質として合成した。この基質を用いて、加水分解活性を指標としたスクリーニングを行った結果、エステル加水分解への触媒活性を示すRNPリセプターを得ることに成功した。
（2）受容体と酵素が共同して働く分子コンビナート
6種類の蛍光分子のライブラリーをペプチドサブユニットに導入した「蛍光分子修飾ペプチドサブユニットライブラリー」を作製し、ATP結合性RNAサブユニットと複合体形成させてRNPライブラリーを作製した。その中から蛍光強度変化比を指標にしてRNPセンサーを選択した。
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| Strategy for Future Research Activity |
「特定の酵素をDNAナノ構造体上の設計した場所に配置するアダプター」および「特定の酵素をDNAナノ構造体上の設計した場所に共有結合によって配置するアダプター」の種類を増やし、３種類の酵素を特定の距離に特定の分子数比で配置した用いた人工代謝経路を構築する。この方法論を「リブロース1,5－ビスリン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ（RubisCO）の炭素固定反応を促進する反応場」の構築にも応用し、共有結合型GCN4アダプターを融合したG-RuBisCO、zSアダプターを融合したカーボニックアンヒドラーゼ（zS-CA）を様々な様式でDNAナノ構造体上に配置した炭素固定反応を検証する。さらに、DNAナノ構造体上に様々な集積度でNAD+リセプターを配置する事によって、同一構造体上に配置されたキシロース還元酵素（XR）とキシリトール脱水素酵素（XDH）による酵素反応を調べる。
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