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2015 Fiscal Year Annual Research Report

人工制限酵素を用いたゲノム編集技術の開発とその応用

Research Project

Project/Area Number 25250014
Research InstitutionOsaka University

Principal Investigator

伊川 正人  大阪大学, 微生物病研究所, 教授 (20304066)

Project Period (FY) 2013-04-01 – 2017-03-31
Keywordsゲノム編集 / 生殖不全 / 遺伝子破壊 / 点変異 / ノックイン / CRISPR/Cas9 / 男性避妊薬
Outline of Annual Research Achievements

『目的』人工制限酵素という最新技術を、申請者が得意とするウイルスベクターやES 細胞などと組み合わせ、任意の遺伝子改変を可能にするオンデマンドゲノム編集システムを開発する。さらに開発した遺伝子組換え技術・動物を用いて、社会問題にもなっている不妊・不育のメカニズム解明を目指す。なお開発した遺伝子組換え技術および動物は、公的機関を通して広く生命科学研究者に提供する。
『実施概要』本研究では以下の2つを大きな柱にして研究を進めている。
I.オンデマンドゲノム編集システムの開発:これまでにCas9とsgRNAを共発現するプラスミドを受精卵の前核に注入する手法を開発したが、点変異やノックインなどの複雑な遺伝子改変が難しいことから、次善策の検討を行った。これまでに、ES細胞を用いることで単純遺伝子破壊だけでなく、2本鎖DNAを鋳型として10遺伝子で点変異やタグ挿入を試みた。その結果、受精卵注入では得られないほどの低率のsgRNAを使った場合でも、ES細胞であれば容易に目的変異体を得られることを示した。また受精卵操作では、得られた産仔がモザイク状態になるため、遺伝子型解析や表現型解析が困難である点についても、クローン化できるES細胞の利点を活かせば解決できることを示した。
II.生殖不全マウスの重点解析:区分Iで得られた遺伝子改変マウスについて、交配による妊孕性試験を行い樹立した雄性不妊系統について表現型解析およびメカニズム解析を進めた。H27年度は、精子カルシニューリン(PPP3CC/PPP3R2複合体)が、精子の中片部の屈曲性を制御していること、さらに阻害剤が男性避妊薬開発に繋がる可能性があることを示し、Science誌に発表した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

CRISPR/Cas9システムとES細胞を組み合わせることで、効率的な遺伝子改変システムを構築できたことから、順調に進展していると判断した。さらに精子カルシニューリンが精子の成熟に必須であり、その阻害薬が男性避妊薬の開発に繋がることをScience誌に報告できたことなどを総合的に考慮し、当初の計画以上に進展していると判断した。

Strategy for Future Research Activity

単純な遺伝子破壊と異なり、点変異やノックインなどの複雑な遺伝子改変を受精卵で行うことは難しい。複雑な遺伝子改変はES細胞で組み合わせることで、効率化を計る。またES細胞利点を活かし、従来のように遺伝子改変マウス系統を樹立して解析するのではなく、第一世代のキメラ動物を用いて機能解析する手法を確立する。

Research Products

(15 results)

All 2016 2015 Other

All Int'l Joint Research Journal Article Presentation

  • [Int'l Joint Research] Baylor College of Medicine(USA)

    • Country Name
      USA
    • Counterpart Institution
      Baylor College of Medicine
  • [Int'l Joint Research] University of Alberta(Canada)

    • Country Name
      Canada
    • Counterpart Institution
      University of Alberta
  • [Int'l Joint Research] University of New Castle(Australia)

    • Country Name
      Australia
    • Counterpart Institution
      University of New Castle
  • [Journal Article] Calreticulin Regulates Neointima Formation and Collagen Deposition following Carotid Artery Ligation.2015

    • Author(s)
      Zimmerman KA, Xing D, Pallero MA, Lu A, Ikawa M, Black L, Hoyt KL, Kabarowski JH, Michalak M, Murphy-Ullrich JE
    • Journal Title

      J Vasc Res.

      Volume: 52 Pages: 306-320

    • DOI

      10.1159/000443884.

    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Sperm calcineurin inhibition prevents mouse fertility with implications for male contraceptive.2015

    • Author(s)
      Miyata H, Satouh Y, Mashiko D, Muto M, Nozawa K, Shiba K, Fujihara Y, Isotani A, Inaba K, Ikawa M
    • Journal Title

      Science.

      Volume: 350 Pages: 442-445

    • DOI

      10.1126/science.aad0836.

    • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] CRISPR/Cas9-Mediated Rapid Generation of Multiple Mouse Lines Identified Ccdc63 as Essential for Spermiogenesis.2015

    • Author(s)
      Young SA, Miyata H, Satouh Y, Kato H, Nozawa K, Isotani A, Aitken RJ, Baker MA, Ikawa M
    • Journal Title

      Int J Mol Sci.

      Volume: 16 Pages: 24732-24750

    • DOI

      10.3390/ijms161024732.

    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] Sperm postacrosomal WW domain-binding protein is not required for mouse egg activation.2015

    • Author(s)
      Satouh Y, Nozawa K, Ikawa M
    • Journal Title

      Biol Reprod.

      Volume: 93 Pages: 94

    • DOI

      10.1095/biolreprod.115.131441.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Calreticulin is required for development of the cumulus oocyte complex and female fertility.2015

    • Author(s)
      Tokuhiro K, Satouh Y, Nozawa K, Isotani A, Fujihara Y, Hirashima Y, Matsumura H, Takumi K, Miyano T, Okabe M, Benham AM, Ikawa M
    • Journal Title

      Sci Rep.

      Volume: 5 Pages: 14254

    • DOI

      10.1038/srep14254.

    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Double strand break repair by capture of retrotransposon sequences and reverse-transcribed spliced mRNA sequences in mouse zygotes.2015

    • Author(s)
      Ono R, Ishii M, Fujihara Y, Kitazawa M, Usami T, Kaneko-Ishino T, Kanno J, Ikawa M, Ishino F.
    • Journal Title

      Sci Rep.

      Volume: 5 Pages: 12281

    • DOI

      10.1038/srep12281.

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] APJ Regulates Parallel Alignment of Arteries and Veins in the Skin.2015

    • Author(s)
      Kidoya H, Naito H, Muramatsu F, Yamakawa D, Jia W, Ikawa M, Sonobe T, Tsuchimochi H, Shirai M, Adams RH, Fukamizu A, Takakura N.
    • Journal Title

      Dev Cell.

      Volume: 33 Pages: 247-259

    • DOI

      10.1016/j.devcel.2015.02.024.

    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] One-step generation of multiple transgenic mouse lines using an improved Pronuclear Injection-based Targeted Transgenesis (i-PITT).2015

    • Author(s)
      Ohtsuka M, Miura H, Mochida K, Hirose M, Hasegawa A, Ogura A, Mizutani R, Kimura M, Isotani A, Ikawa M, Sato M, Gurumurthy CB
    • Journal Title

      BMC Genomics.

      Volume: 16 Pages: 274

    • DOI

      10.1186/s12864-015-1432-5.

    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Presentation] 精子特異的カルシニョーリンによる精子運動性の制御メカニズム2016

    • Author(s)
      伊川 正人
    • Organizer
      生命資源研究・支援センターシンポジウム
    • Place of Presentation
      熊本大学生命資源研究・支援センター(熊本県熊本市)
    • Year and Date
      2016-03-11 – 2016-03-11
    • Invited
  • [Presentation] CRISPR/Cas9システムを用いたマウスゲノム編集2015

    • Author(s)
      伊川 正人
    • Organizer
      第7回遺伝子組換え実験安全研修会
    • Place of Presentation
      一橋大学一橋講堂(東京都千代田区)
    • Year and Date
      2015-08-01 – 2015-08-01
    • Invited
  • [Presentation] CRISPR/Cas-Mediated Genome Editing in Mice and Its Application for the Study of Reproduction2015

    • Author(s)
      伊川 正人
    • Organizer
      第48回米国生殖学会会議(SSR 2015 Annual Meeting)
    • Place of Presentation
      Puerto Rico Convention Center(プエルトリコ・サンファン)
    • Year and Date
      2015-06-18 – 2015-06-22
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] 遺伝子改変動物が導く受精メカニズムの新論争2015

    • Author(s)
      伊川 正人
    • Organizer
      第60回日本生殖医学会学術講演会・IFFS/JSRM International Meeting 2015
    • Place of Presentation
      パシフィコ横浜(神奈川県・横浜市)
    • Year and Date
      2015-04-26 – 2015-04-29
    • Int'l Joint Research / Invited

URL: 

Published: 2017-01-06  

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