Wnt5aシグナルによるがんの悪性化の分子機構の解明とその分子標的薬の開発

2013 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 25250018
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 菊池 章 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (10204827)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 麓 勝己 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (40467783) ; 松本 真司 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (20572324)
• Project Period (FY): 2013-10-21 – 2016-03-31
• Keywords: Wnt5a / シグナル伝達 / がん / 転移 / ハイスループットスクリーニング

Outline of Annual Research Achievements

平成25年度は、平成25年10月21日に内定通知があり平成26年7月末まで繰り越して、交付申請書に記載した研究計画にしたがって実験を遂行し、下記の成果を得た。１）Wnt5aの分泌機構を明らかにするために、精製Wnt5aタンパク質の翻訳後修飾を質量分析法により同定した。Wnt3aやWnt11と同様に、Wnt5aも244番のセリンにパルミトレイン酸が付加されていた。また、Wnt5aの114番と326番の高マンノース型、312番のNに混成型糖鎖が付加されていた。２）Wnt5aの分泌阻害化合物の探索において、Wnt5aを検出するハイスループットのELISAアッセイ系を構築し、15,000化合物のスクリーニングを実施した。その結果、細胞毒性が低く濃度依存性にWnt5a分泌を抑制する4化合物を同定した。Wnt5a-受容体結合阻害化合物の探索では、受容体の細胞外領域にIgGのFc領域を融合させたタンパク質を固相化し、Wnt5aと受容体の結合を検出するELISAアッセイ系を構築した。このアッセイ系をハイスループット化し、2,000化合物についてテストスクリーニングを行った。その結果、濃度依存性にWnt5aと受容体の結合を阻害する3化合物を見出した。３）塩野義製薬との共同研究による抗Wnt5aモノクローナル抗体の作製については、ファージディスプレイ法により8種類のFab抗体クローンを選別した。ELISAおよびウエスタンブロット法により、7種類のFab抗体クローンがWn5aを認識することを確認した。さらに、その中からin vitroにおいて胃癌細胞の浸潤能を阻害するFab抗体クローンを1種類選別した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

線維芽細胞を用いた解析から、Wntは小胞体からゴルジ体への輸送にTMED5(transmembrane emp24 protein transport containing domain 5)、ゴルジ体から細胞外への輸送にはWntlessが関与することは報告されているが、詳細な分泌機構は明らかにされていなかった。一方、極性化された上皮細胞において膜タンパク質や分泌タンパク質がトランスゴルジ網（TGN）から頂端部、あるいは側底部へ異なる機構で選別輸送される。これまでに、Wntシグナルが細胞極性の制御に重要な機能を果たしていることは示されてきたが、Wnt自身が極性化された上皮細胞において頂端部または側底部のいずれに分泌されるかは解析されていない。また、Wntはアスパラギン結合型糖鎖が付加されるが、Wntの糖鎖構造と細胞内輸送との関連は不明であった。私共はこれまでにWnt3aとWnt11の脂質修飾ならびに糖鎖修飾の上皮細胞の極性分泌における役割を明らかにした。本年度に、Wnt5aの翻訳後修飾を決定できたので、脂質修飾と糖鎖修飾Wnt5aの分泌機構を解明できると考えている。また、すでに構築していた分泌されたWnt5aを定量するHTPアッセイ系を用いて、化合物ライブラリーからWnt5a分泌阻害候補分子を4化合物同定した。さらに、Wnt5a-受容体結合を検出するELISAアッセイ系を構築し、濃度依存性にWnt5aと受容体の結合を阻害する3化合物を同定できた。これまで、Wnt5aモノクローナル抗体を作製できなかったが、本年度ファージディスプレイ法を用いてFab抗体クローンを1種類選別できたことは大きな進歩であった。

Strategy for Future Research Activity

極性化された上皮細胞において膜タンパク質の頂端部への輸送シグナルの一つにN結合型糖鎖が報告されている。Wnt3aやWnt5aとWnt11の糖鎖修飾の違いを考えると、N末端側に付加される複合型糖鎖が極性分泌に関連すると考えられた。来年度は、Wnt5aの上皮細胞における極性分泌の方向性を決定するともに、Wnt5aのN末端側に糖鎖修飾部位を挿入した変異体を作製して、分泌方向を変化させることができるようにする。その上で、Wnt5aの極性分泌の上皮細胞における役割を明らかにする。Wnt5aと受容体との結合阻害化合物の同定に関して、平成26年度末までに、現在構築しているELISAを改良し、精度や感度を向上させる。Wnt5aを蛍光標識し、固相化した受容体-Fc(IgG)タンパクに結合したものを直接測定することにより、感度の改善が期待できる。そのために、生理的な活性を保持したまま効果的にWnt5aを蛍光標識する方法を確立する必要がある。抗Wnt5aモノクローナル抗体の作製に関しては、Fab抗体から完全IgG1型抗体を作製して、単離されたモノクローナル抗体が中和活性を有するかを明らかにする。さらに、エピトープや作用機序を明確化し、既存の抗体との進歩性を明らかにする。

Research Products

• [Journal Article] Basolateral secretion of Wnt5a in polarized epithelial cells is required for apical lumen formation. (2015)
  • Author(s): Yamamoto, H., Awada, C., Matsumoto, S., Kaneiwa, T., Sugimoto, T., Takao, T., and Kikuchi, A.
  • Journal Title: J. Cell Sci. Volume: 128 Pages: 1051-1063
  • DOI: 10.1242/jcs.163683.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The P2Y2 receptor promotes Wnt3a and EGF-induced epithelial tubular formation of IEC6 cells by binding to integrins (2015)
  • Author(s): Ibuka, S., Matsumoto, S., Fujii, S., and Kikuchi, A.
  • Journal Title: J. Cell Sci. Volume: In press Pages: In press
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Arl4c expression in colorectal and lung cancers promotes tumorigenesis and may represent a novel therapeutic target (2015)
  • Author(s): Fujii, S., Matsumoto, S., Nojima, S. Morii, E., and Kikuchi, A.
  • Journal Title: Oncogene Volume: In press Pages: In press
  • DOI: 10.1038/onc.2014.402.
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Wnt5a promotes cancer cell invasion and proliferation by receptor-mediated endocytosis-dependent and -independent mechanisms, respectively (2015)
  • Author(s): Shojima, K., Sato, A., Hanaki, H., Tsujimoto, I., Nakamura, M., Hattori, K., Sato, Y., Dohi, K., Hirata, M., Yamamoto, H., and Kikuchi, A.
  • Journal Title: Sci. Rep. Volume: 5 Pages: 8042
  • DOI: 10.1038/srep08042.
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] A combination of Wnt and growth factor signaling induces Arl4c expression to form epithelial tubular structures (2014)
  • Author(s): Matsumoto, S., Fujii, S., Sato, A., Ibuka, S., Kagawa, Y., Ishii, M., and Kikuchi, A.
  • Journal Title: EMBO J. Volume: 33 Pages: 702-718
  • DOI: 10.1002/embj.201386942.
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Cell ｃycle-ｄependent Rho GTPase activity dynamically regulates cancer cell motility and invasion in vivo (2013)
  • Author(s): Kagawa, Y., Matsumoto, S., Kamioka, Y., Mimori, K., Naito, Y., Ishii, T., Okuzaki, D., Nishida, N., Maeda, S., Naito, A., Kikuta, J., Nishikawa, K., Nishimura, J., Haraguchi, N., Takemasa, I., Mizushima, T., Ikeda, M., Yamamoto, H., Sekimoto, M., Ishii, H., Doki, Y., Matsuda, M., Kikuchi, A., Mori, M., and Ishii, M.
  • Journal Title: PLoS ONE Volume: 8 Pages: e83629
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0083629.
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Wnt5a signaling promotes apical and basolateral polarization of single epithelial cells (2013)
  • Author(s): Gon H, Fumoto K, Ku Y, Matsumoto, S., and Kikuchi, A.
  • Journal Title: Mol. Biol. Cell. Volume: 24 Pages: 3764-3774
  • DOI: 10.1091/mbc.E13-07-0357.
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Apical and basolateral secretion of Wnt11 and Wnt3a in polarized epithelial cells is regulated by different mechanisms (2013)
  • Author(s): Yamamoto, H., Awada, C., Hanaki, H., Sakane, H., Tsujimoto, I., Takahashi, Y., Takao, T., and Kikuchi, A.
  • Journal Title: J. Cell Sci. Volume: 126 Pages: 2931-2943
  • DOI: 10.1242/jcs.126052.
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Wnt5a signaling mediates biliary differentiation of fetal hepatic stem/progenitor cells (2013)
  • Author(s): Kiyohashi, K., Kakinuma, S., Kamiya, A., Sakamoto, N., Nitta, S., Yamanaka, H., Yoshino, K., Fijuki, J., Murakawa, M., Kusano-Kitazume, A., Shimizu, H., Okamoto, R., Azuma, S., Nakagawa, M., Asahina, Y., Tanimizu, N., Kikuchi, A., Nakauchi, H., and Watanabe, M.
  • Journal Title: Hepatology Volume: 57 Pages: 2502-2513
  • DOI: 10.1002/hep.26293.
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] Epithelial tubulogenesis by growth factor signaling and tumorigenesis due to its abnormality (2014)
  • Author(s): Akira Kikuchi
  • Organizer: The 39th Annual Meeting of the Japanese Society for Investigative Dermatology.
  • Place of Presentation: ホテル阪急エキスポパーク
  • Year and Date: 2014-12-14 – 2014-12-14
  • Invited
• [Presentation] Wnt5a signaling; its implication in cancer and inflammation (2014)
  • Author(s): Akira Kikuchi
  • Organizer: University of Washington and Kobe University International Joint Symposium
  • Place of Presentation: 神戸ポートピアホテル
  • Year and Date: 2014-12-05 – 2014-12-15
  • Invited
• [Presentation] Epithelial tubular formation by a combination of growth factor signaling and tumorigenesis due to its abnormality (2014)
  • Author(s): Akira Kikuchi
  • Organizer: 14th Japanese-German Cancer Workshop
  • Place of Presentation: Hotel Adina, Berlin, Germany
  • Year and Date: 2014-11-14 – 2014-11-16
  • Invited
• [Presentation] Regulation of tubulogenesis by growth factor signaling and its implication in tumorigenesis (2014)
  • Author(s): Akira Kikuchi
  • Organizer: 第87回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 国立京都国際会館
  • Year and Date: 2014-10-17 – 2014-10-17
  • Invited
• [Presentation] 増殖因子シグナルによる上皮管腔組織形成とその破綻による発がん (2014)
  • Author(s): 菊池章
  • Organizer: 第73回日本癌学会総会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜
  • Year and Date: 2014-09-26 – 2014-09-26
  • Invited
• [Presentation] Development of epithelial tube formation by growth factor signaling and tumorigenesis due to its abnormality (2014)
  • Author(s): Akira Kikuchi
  • Organizer: 2014 KSBMB Annual Meeting
  • Place of Presentation: COEX, Seoul, Korea
  • Year and Date: 2014-05-14 – 2015-05-16
  • Invited
• [Presentation] 上皮管腔構造形成のメカニズムと細胞のがん化 (2014)
  • Author(s): 菊池章
  • Organizer: 第103回日本病理学会総会
  • Place of Presentation: 広島国際会議場
  • Year and Date: 2014-04-25 – 2014-04-25
  • Invited
• [Presentation] 上皮管腔組織形成とその異常によるがん (2014)
  • Author(s): 菊池章
  • Organizer: 山村雄一記念ライフホール開設講演会
  • Place of Presentation: 千里ライフサイエンスセンター山村雄一記念ライフホール
  • Year and Date: 2014-04-23 – 2014-04-23
  • Invited
• [Presentation] 上皮管腔組織形成とその異常によるがん (2014)
  • Author(s): 菊池章
  • Organizer: 愛媛大学プロテオサイエンスセンター第1回学術シンポジウム
  • Place of Presentation: 愛媛大学
  • Year and Date: 2014-03-01 – 2014-03-01
  • Invited
• [Presentation] 上皮管腔組織形成とその異常によるがん (2013)
  • Author(s): 菊池章
  • Organizer: 金沢がん進展制御研究所共同利用・共同研究拠点シンポジウム
  • Place of Presentation: 金沢大学
  • Year and Date: 2013-11-09 – 2013-11-09
  • Invited
• [Book] Wnt Signaling (Chapter8, Wnt signaling in Development and Disease) (2014)
  • Author(s): Akira Kikuchi, Shinji Matsumoto, Katsumi Fumoto, and Akira Sato.
  • Total Pages: 472
  • Publisher: John Wiley and Sons, Inc
• [Remarks] 分子病態生化学
  • URL: http://www.med.osaka-u.ac.jp/pub/molbiobc/
• [Patent(Industrial Property Rights)] CKAP4を標的分子とした抗腫瘍剤 (2015)
  • Inventor(s): 菊池 章
  • Industrial Property Rights Holder: 菊池 章
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: K20140017
  • Filing Date: 2015-02-27
• [Patent(Industrial Property Rights)] ヒトがんにおけるArl4cの高発現と発現抑制による抗腫瘍効果の発見 (2014)
  • Inventor(s): 菊池 章
  • Industrial Property Rights Holder: 菊池 章
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: K20140141
  • Filing Date: 2014-09-09