2014 Fiscal Year Annual Research Report
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25250028
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| Research Institution | Nara Institute of Science and Technology |
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Principal Investigator |
森 浩禎 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 教授 (90182203)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田村 武幸 京都大学, 化学研究所, 助教 (00437261)
松野 浩嗣 山口大学, 理工学研究科, 教授 (10181744)
山田 守 山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (30174741)
牧 泰史 大阪医科大学, 医学部, 講師 (60401733)
中東 憲治 慶應義塾大学, その他の研究科, 准教授 (70322740)
遠里 由佳子 独立行政法人理化学研究所, その他部局等, 研究員 (80346171)
片岡 正和 信州大学, 工学部, 准教授 (90332676)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 大腸菌 / 分子バーコード / 一遺伝子欠失株 / deep sequence / 貞コピー可動型発現プラスミド / population変動 / Multiplex解析 / Chemical Genomics |
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| Outline of Annual Research Achievements |
モデル大腸菌K-12株を活用し、化学物質と遺伝子産物との相互作用解析を目的に20塩基の分子バーコードを導入した一遺伝子欠失株ライブラリーの構築を試み、欠失株としての評価を終え、すべてのバーコード領域の配列決定後、ライブラリーとして確立した。このライブラリーを用いて、本年度は２つの大規模解析への可能性の検証を行った。1)すべての欠失株を混合した培養液を用いた、長期定常期中のpopulation変動の定量的解析、2) 同じく混合培養液を用いて、化学物質を含んだ培地中の各欠失株のpopulation変動解析、の二つを行いバーコード欠失株の有用性を確認することができた。一方、1)の長期定常期での欠失遺伝子の影響を調べた解析では、特定のバーコード領域の増大と、再び生育可能な状態になった環境での次のpopulationを築く遺伝子欠失株とが必ずしも一致しないという問題を持つことが判明した。これはゲノムDNAが細胞の形態が保たれていてDNA分解酵素などから保護される状態にありながら、次の世代として再び細胞分裂を開始することができない、あるいは非常に遅れて生育する可能性を示している。そのため、長期間の培養液から経時的にサンプリングを行い、一部は前回と同様にバーコードの頻度をシーケンスで確認し、残る培養液はフレッシュな培地に替え、再び生育させ、一定時間後にシーケンスによりバーコードの頻度を調べ、遺伝子欠失と再生育能力との相関の解析を進めた。シーケンス解析自体は次年度に持ち越している。接合伝達可能な低コピープラスミドクローンライブラリーの構築を行い、ライブラリーとして確立した。そして上述のバーコード欠失株を相補するライブラリーの構築も終了し、相補株におけるバーコード解析を可能にした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
一遺伝子バーコード欠失株ライブラリーの構築を終了し、最初のパイロットテストを、長期定常期におけるpopulation変動及び薬剤を含む培地での欠失遺伝子と薬剤との相互作用を定量的に解析するシステムの構築を完成した。また本年度はプラスミドから該当遺伝子の増産による影響もバーコード解析を可能にするライブラリーの構築を行った。予定以上に進展した事は、リソース及び方法論の確立により、急速に共同研究も拡張、発展していることも大きい。
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| Strategy for Future Research Activity |
来年度は、最終年度でもあり、まず構築したリソースを活用して得られた大量の情報の解析を進めることと、論文化を中心に進める。また、これまで開発を行った低コピー可動プラスミドは、Fプラスミドの移動起点(oriT)を持つ。これは、大腸菌間では非常に効率良くプラスミドの移動を可能にするが、incPプラスミドのRP4由来のoriTを利用することで、大腸菌-放線菌間など種を超えた接合による移動を可能にする。接合は通常の形質転換とは違い、巨大DNAの移動を可能にする。すでにこれまでのベクターにRP4由来のoriTを導入したプラスミドを構築できており、巨大DNA移動システム構築など、応用へ向けた拡張を図る。
さらに本プロジェクト終了後を本プロジェクトで得られたリソースや方法論をベースに、我々としては、今後10年、20年のスパンでシーズを出し続けることができるような基礎、基盤研究に目を向けた研究を中心に進めること、そして研究グループ内外を問わず、共同研究等で短期的な活用に向けた方向に応用できるような体制を取れるような仕組みを検討する。
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Research Products
(21 results)
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[Journal Article] Systematic Production of Inactivating and Non-Inactivating Suppressor Mutations at the relA Locus That Compensate the Detrimental Effects of Complete spoT Loss and Affect Glycogen Content in Escherichia coli.2014
Author(s)
Montero M, M Rahimpour, AM Viale, G Almagro, G Eydallin, A Sevilla, M Canovas, C Bernal, AB Lozano, FJ Munoz, E Baroja-Fernandez, A Bahaji, H Mori, FM Codoner, & J Pozueta-Romero
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Journal Title
PloS one
Volume: 9
Pages: e106938
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Unprecedented high-resolution view of bacterial operon architecture revealed by RNA sequencing.2014
Author(s)
Conway T, JP Creecy, SM Maddox, JE Grissom, TL Conkle, TM Shadid, J Teramoto, P San Miguel, T Shimada, A Ishihama, H Mori, & BL Wanner
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Journal Title
mBio
Volume: 5
Pages: e01442-14
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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