2013 Fiscal Year Annual Research Report
細胞によるRNAポリメラーゼII転写産物のソーティング機構
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25251004
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
大野 睦人 京都大学, ウイルス研究所, 教授 (80201979)
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| Project Period (FY) |
2013-10-21 – 2018-03-31
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| Keywords | RNAポリメラーゼII / RNA核外輸送 / mRNA / U snRNA / hnRNP |
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| Research Abstract |
１．hnRNP Cの４量体がどのようにして200-300塩基長を認識できるのかを構造生物学的手法で明らかにする（EMBL、GrenobleのStephen Cusack博士との共同研究）。hnRNP Cのホモ４量体を大腸菌で精製するが、結晶化に必要な発現量を得る条件を検討している。
２．４量体は核内でRNAから解離して輸送因子などと置き換わると考えられるので、その解離・置換のダイナミックなメカニズムを明らかにする。HeLa細胞核抽出液中に、４量体をRNAから解離させる活性が存在することが分かった。この活性はATPに依存していた。しかし、HeLa細胞核抽出液中からUAP56を抗体を用いて除去しても活性は変わらなかったことから、この活性の正体の第一候補であったUAP56の可能性は消えた。
３．４量体をノックダウンした細胞中では、U snRNA輸送因子がmRNAに結合してしまうという異常な事態が起こり、このような異常mRNAの核外輸送が停止されることが分かっている。このようなmRNA複合体の異常を感知して発現を止める新規核内mRNA監視機構を明らかにする。この新規核内mRNA監視機構を明らかにするために、コントロールKD HeLa細胞、hnRNP C KD細胞、hnRNP CとPHAXの２重KD細胞の３種類の細胞からRNAを抽出し、RNAの大規模シークエンシングを行った。hnRNP C KD細胞で発現上昇し２重KD細胞で正常に戻る遺伝子群に特に着目し、それらをqRT-PCRで確認する作業に入っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1番の構造生物学的アプローチが発現量の問題でややもたついているものの、その他についてはほぼ順調に推移している。
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| Strategy for Future Research Activity |
基本的に当初の計画通り進める。
１については、Stephen Cusack博士と緊密に連絡を取り進める。
２については、UAP56以外のRNAヘリカーゼの関与を調べる。さらに、リン酸化の関与を調べる予定である。
３については、qRT-PCRで遺伝子発現の変動を詳細に確認し、この新規核内mRNA監視機構に関与するかもしれない経路を洗い出す予定である。
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