2014 Fiscal Year Annual Research Report
植物の減数分裂進行を支えるRNAを介した制御システムの研究
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25252004
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| Research Institution | National Institute of Genetics |
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Principal Investigator |
野々村 賢一 国立遺伝学研究所, 実験圃場, 准教授 (10291890)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 遺伝学 / 育種学 / 植物 / 発生・分化 / 細胞・組織 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1. 減数分裂の移行に必須のイネMEL2は、標的mRNAに結合して翻訳を制御する可能性が高い。そこで突然変異体の葯を用いた２次元電気泳動を行い、変異体で増加する６つ、および減少する７つの蛋白質スポットを同定した。質量分析によりそれぞれのスポットに含まれる蛋白質の部分アミノ酸配列を同定し、イネゲノム情報を用いて対応遺伝子をリストアップした。過去の報告から減数分裂での機能が推測される遺伝子も含まれていた。
2. イネの減数第一分裂の進行に必須のアルゴノート（AGO）蛋白質MEL1を免疫沈降し、一緒に回収される蛋白質を質量分析したところ、RNA二次構造をほどく機能をもつRNAヘリカーゼなど、いくつかの興味深い蛋白質を同定した。また蛋白質の翻訳を担うリボソーム構成蛋白質が多数検出された。MEL1は粗面小胞体上のリボソームと結合する可能性を示す昨年の結果とよく一致し、MEL1が減数分裂で蛋白質の翻訳を制御する可能性が益々高まった。
MEL1が減数分裂染色体のクロマチン構造に与える影響を調べるため、ヒストンH3の修飾や、転写を行うRNAポリメラーゼIIの細胞内局在を観察した。その結果、正常なイネ生殖細胞の減数第一分裂初期ではゲノムワイドに転写が不活化されており、不活化にはMEL1機能が必須であることを示した。
3. 減数分裂細胞を保育する周辺体細胞の層分化に機能する転写因子TTMが、生殖特異的small RNAの生合成に必要なDCL遺伝子や、small RNA前駆体遺伝子の転写を促進することを見いだした。特にDCL遺伝子については、TTMが直接上流の調節領域に結合して転写を促していることを明らかにした。TTMによって生合成が促進されるsmall RNAのなかには、MEL1結合small RNAに含まれるものもあり、生殖細胞と周辺体細胞との細胞間相互作用の観点から極めて興味深い結果が得られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
申請当初は、３つのイネRNA結合蛋白質の機能解析を計画しており、２つの蛋白質（MEL1、MEL2）については、概ね計画通り順調に進捗した。MEL2解析では、MEL2が結合するRNAコンセンサス配列の同定と、MEL2が標的とする遺伝子の候補を絞り込むことができた。この成果は現在、国際科学雑誌に投稿中である。またプロテオーム解析によりMEL2の翻訳制御を受ける可能性のある候補遺伝子を同定できた。MEL1解析では、MEL1と結合するsmall RNA（masiRNA）の同定と、masiRNAが由来するゲノム領域を特定することに成功し、成果は著名な国際誌 (The Plant Journal) に発表した。またMEL1が減数分裂特異的なクロマチン修飾制御に必須の役割を果たすことも明らかにし、現在論文を執筆中である。いずれも過去に報告のない新規の結果であり、植物の減数分裂進行にはRNA結合蛋白質が仲介するエピジェネティックな制御機構が必要不可欠であることを実証できたと自負する。
当初計画していたAGO３蛋白質に代わる解析として、減数分裂細胞を保育する周辺体細胞の発生に機能する転写因子TTMの解析を行い、タペート組織は生殖特異的small RNAの生合成の場として生殖細胞の発生あるいは減数分裂に重要な役割を担い、TTMがsmall RNA生合成関連遺伝子の転写を直接あるいは間接的に促進することを明らかにできたことは、生殖細胞発生研究の観点から極めて重要な成果となった。
MEL1、MEL2の解析では、それらの下流で機能する遺伝子の解析に向けた手がかりを得ることに成功し、MEL1についてはTTMの解析を通じて上流のsmall RNA生合成経路に結びつく手がかりを得ることにも成功した。従って植物の減数分裂進行を支えるRNAを介した制御ネットワークの解明に向けて、順調に進展していると自負する。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. 今年度作成したMEL2-GFP融合蛋白質を発現する形質転換イネを用いて、生体内でMEL2と結合するRNA配列の同定を試みる。また二次元電気泳動で選抜されたいくつかの標的候補遺伝子の機能について、ゲノム編集技術により突然変異体を作成して表現型を観察する。成功すれば、植物の減数分裂移行のタイミング制御に関わるMEL2を頂点とした遺伝子制御カスケードの一端が明らかになると期待できる。
2. これまでの研究から、MEL1蛋白質の大半は生殖細胞の細胞質に局在し、リボソームと相互作用して遺伝子の翻訳制御に関わる可能性が示唆された。一方で、減数分裂移行期におけるゲノムワイドなクロマチン修飾動態制御に必須であるなど、MEL1機能が核内事象に重要なのは明らかである。実際に、減数分裂初期にMEL1が一過的に核内に移行する可能性を示唆するデータも得ている。今後は、MEL1は本当にリボソームに結合して翻訳を制御しているのか、その際の標的mRNAは何か、またMEL1は核に移行するのか、などの観点から研究を推進する。具体的には、１）MEL1-GFPを発現する形質転換イネでMEL1発現パターンや細胞内局在性を詳細に観察、２）MEL1と相互作用する蛋白質の解析、３）MEL1に依存して転写制御を受ける遺伝子群の解析、４）MEL1標的RNA配列の同定、などを行う。成功すれば、MEL1 AGOおよびsmall RNAが仲介するRNAサイレンシング経路が植物の減数分裂で果たす役割の一端が解明できる。
3. 生殖特異的small RNAの生合成がどこで、どのように行われているのかをさらに明らかにするため、TTMの更なる解析を進める。
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