2015 Fiscal Year Annual Research Report
植物の減数分裂進行を支えるRNAを介した制御システムの研究
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25252004
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| Research Institution | National Institute of Genetics |
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Principal Investigator |
野々村 賢一 国立遺伝学研究所, 実験圃場, 准教授 (10291890)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | イネ / アルゴノート（Argonaute） / 小分子RNA（small RNA） / ノンコーディングRNA / タペート組織 / 雄性不稔 / 転写因子 / 植物 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
減数分裂組み換えは、生物の遺伝的多様性の創出を担う生命現象の一つであり、そのメカニズムの解明は育種効率の向上などにつながる重要課題である。本課題では、イネの減数分裂進行に重要な蛋白質の機能解析を目的とする。
（１）本課題では、減数分裂移行を制御するイネRNA結合蛋白質MEL2が、200個以上の遺伝子のmRNAと結合し得る可能性を明らかにしてきた。今年度はその成果論文をPlant Molecular Biology誌で発表した。また、蛍光蛋白質GFPを融合したMEL2（MEL2-GFP）の細胞から、MEL2が減数分裂直前の生殖細胞の細胞質で斑点状に局在することを明らかにした。
（２）アルゴノート蛋白質（AGO）は、20-30塩基長の小分子RNA（sRNA）と結合し、sRNA配列と相補的な遺伝子の転写後抑制を介して様々な生命現象に関与する。減数分裂の進行に必須のイネAGOであるMEL1は、減数分裂前のイネ生殖細胞で特異的に発現する。今年度は免疫沈降実験（IP）により、MEL1と結合するsRNA・蛋白質を網羅的に同定した。IPおよびMEL1-GFPの顕微鏡観察から、MEL1は減数分裂の初期過程で細胞質と核の両方に存在する可能性を示した。
（３）葯において雄性生殖細胞の保育機能を担うタペート組織で特異的に発現する転写因子TTMが、減数分裂特異的に発現する24塩基長sRNA（24-sRNA）の生合成に関与する複数の遺伝子の転写を活性化することを本課題で明らかにしてきた。今年度は、TTM制御化にある遺伝子を次世代シーケンサで網羅的に解析し、蛋白質をコードする遺伝子座に加えて、24-sRNA前駆体である多数の新規ノンコーディングRNA遺伝子座がTTM依存的に転写されることを見出した。またTTMはタペート細胞のみで発現するにもかかわらず、ttm変異体では減数分裂の遅延などが起こることを見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
MEL2解析では、MEL2が試験管レベル（in vitro）で好んで結合するRNAコンセンサス配列の同定に成功した。また同配列をもち、かつ減数分裂期に発現する249個の遺伝子をイネゲノム中に見出し、平成２７年度に国際科学雑誌で発表した。申請時に登録した連携研究者（助教）が26年度途中で転出したため計画に遅れが生じた。それでもMEL2-GFPを発現する形質転換イネの作出には成功し、当初の予想通り、MEL2の減数分裂直前生殖細胞での細胞質局在が確認でき、MEL2が標的遺伝子の翻訳制御に関与する可能性を示唆する成果となった。
MEL1研究は非常に順調に推移している。予想していたMEL1の生殖細胞細胞質における転写後の遺伝子発現制御に加え、減数分裂初期における核での転写制御を示唆する結果が本課題で得られた。現在、減数分裂期の前後のイネ頴花からRNAを抽出し、mRNAおよびMEL1結合sRNAの発現パターンの推移、およびMEL1と相互作用する蛋白質について、正常個体と変異体で網羅的に比較するためのデータ取得を進めており、既に幾つかの興味い結果が得られている。
TTMの解析は、諸々の理由から継続困難となった減数分裂期AGO3の解析の代わりに26年度から開始した。後発のテーマにもかかわらず、減数分裂期に大量に発現する24-sRNAの生合成がTTM依存的にタペート組織で活性化されることなど、重要な成果を得ることができた。また上記MEL1機能との密接な関連が予想される結果が得られるなど、当初の期待をはるかに超える成果を得つつある。
上記はいずれも過去に報告のない新規の成果であり、平成25から27年度の三年間で既に4報の原著論文を発表した。また現在、２報の論文を国際科学雑誌に投稿・投稿準備中である。これらを総合して本課題は、当初の計画からの遅れをほぼ取り戻し、概ね順調に推移していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
MEL2について、形質転換イネとGFP抗体を用いて、MEL2が生体内（in vivo）で直接結合する標的遺伝子の同定を行う予定である。被子植物の葯のなかでは、数百の雄性生殖細胞の細胞周期が、減数分裂移行に伴い一斉に同調化することが知られる。減数分裂移行および雄性減数分裂の同調化を制御する分子メカニズムは全く解明されていない。本課題によるMEL2の機能解析、およびMEL2の下流因子の同定は、世界的にみても新規性の極めて高い成果になるとともに、植物の減数分裂移行の分子機構に重要な知見を与えることが確実であるため、当初の計画通りに進める。
またMEL1およびTTMの解析から、タペート細胞（体細胞）のTTM依存的24-sRNAが、隣接する雄性減数分裂細胞に運ばれて細胞質のMEL1と結合し、それをきっかけにMEL1が核移行して染色体と結合し、初期減数分裂を制御する、という仮説が浮上してきた。もしこの仮説が正しいと証明できれば、（１）植物の減数分裂進行にsRNAやAGOを含むRNAサイレンシング経路が直接的に働くこと、（２）生殖特異的sRNAが細胞間シグナル伝達因子として機能すること、（３）生殖細胞と周辺体細胞の協調的な発生が、減数分裂進行に必須の役割を果たすこと、などを明らかにすることができる。特にMEL1については、24-sRNAとの結合をさらに精査するとともに、核局在の可能性をさらに検証し、クロマチン免疫沈降法によりMEL1結合ゲノム配列の同定を試みる予定である。
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