2013 Fiscal Year Annual Research Report
酵母における一酸化窒素の生成機構と生理的役割の解明
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25252065
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Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
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| Research Institution | Nara Institute of Science and Technology |
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Principal Investigator |
高木 博史 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 教授 (50275088)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
川本 進 千葉大学, 真菌医学研究センター, 教授 (80125921)
知花 博治 千葉大学, 真菌医学研究センター, 准教授 (30333488)
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| Project Period (FY) |
2013-10-21 – 2016-03-31
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| Keywords | 一酸化窒素 / シグナル伝達 / 酸化ストレス耐性 / 酵母 |
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| Research Abstract |
1) NOの生成機構の解析：生化学的手法によりTah18とDre2のストレス下での相互作用を解析し、ストレスに応答してTah18がDre2から解離することを示唆するデータを得た。
2) NOの生理的役割の解析：野生株とMac1遺伝子破壊株（Δmac1株）を用い、哺乳類NO合成酵素（NOS）の阻害剤（NAME）を添加した条件で、高温ストレス処理を行ったところ、Δmac1株では野生株に比べて有意に生存率が低下した。また、NAMEの添加によって野生株の生存率は低下したが、Δmac1株では生存率に変化はなかったことから、酵母にはNOS由来のNOおよびMac1依存的なストレス耐性機構が存在することが示された。また、野生株では高温ストレスに伴い、銅含量およびSod1活性が上昇するのに対し、Δmac1株やNAME処理した野生株では両者の上昇は見られなかった。さらに、高温ストレス下ではMac1の標的である銅トランスポーター遺伝子CTR1の転写量が増加していたが、NAME処理によって転写量の増加は抑制された。これらの結果は、ストレス下で発生するNOがMac1を活性化し、銅の取り込み系を亢進することで銅含量を増加させ、Sod1活性の上昇を引き起こし、ストレス耐性を獲得するという仮説を強く支持している。
3) 病原真菌におけるNOの生成機構・生理的役割の解析と病原性への寄与の検証：A. fumigatus やC. glabrataのプロモーター部位を改変して、Tah18発現抑制株をそれぞれ構築して解析を進め、C. glabrata Tah18発現抑制株のカイコ感染実験では野生株と比較して毒性が顕著に低下していることを見出した。また、C. neoformans Mpr1遺伝子破壊株を作製、解析し、50℃の熱ショックに対し、野生型より高い感受性を示すことを見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
酵母におけるNOの生理的役割について、NOが転写因子Mac1を活性化し、銅の取込み系を亢進することで細胞内の銅含量を増加させ、抗酸化酵素Sod1の活性化を介して酸化ストレス耐性を獲得する機構を明らかにできた。また、病原真菌においても、NO合成関連遺伝子の破壊株や発現抑制株の構築と機能解析を進めることができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
1) NOの生成機構の解析：酸化ストレス下においてTah18-Dre2複合体が解離するのか、また解離によってNOレベルが増加するのかを検討する。具体的には、共免疫沈降法を行うことで相互作用の検出系を確立し、酸化ストレス（過酸化水素、高温処理など）による解離の確認とNOレベルの測定を行う。また、Tah18とDre2の解離機構についても検討する。さらに、過酸化水素処理で複合体が解離する時のTah18およびDre2の修飾を質量分析によって解析する。
2) NOの生理的役割の解析：クロマチン免疫沈降法によってMac1がNO依存的に銅代謝関連遺伝子群のプロモーター領域に結合するかどうか調べる。また、ビオチン・スイッチ法を用いて、Mac1のS-ニトロソ化を確認する。次に、NOによるS-ニトロソ化に伴って、実際に銅イオンの遊離が起こるかを原子吸光分析などで検討する。さらに、Mac1が結合するDNA領域をChip-Seq解析により明らかにし、Mac1を介した抗酸化機構の解明を目指す。
3) 病原真菌におけるNOの生成機構・生理的役割の解析と病原性への寄与の検証：各病原真菌において、酵母S. cerevisiaeのNO生成に関与する酵素（Mpr1, Tah18）の遺伝子破壊株、発現抑制株、過剰発現株などを用いてさらに解析、考察を進める。各菌株の細胞内NOを定量し、また各種ストレス耐性などの表現型を調べることによって、これら病原真菌でMpr1やTah18がNOS活性の発現に関与するか、すなわちMpr1またはTah18依存的なNO合成やストレス耐性などが観察されるかなどについて、S. cerevisiae の実験系を参考にして詳細に解析する。
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