2013 Fiscal Year Annual Research Report
シナプス伝達におけるグルタミン酸充填量制御メカニズムの構造生物学的解明とその応用
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25253008
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
森山 芳則 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (10150658)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
宮地 弘幸 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (20376643)
井上 剛 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 准教授 (40370134)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 生化学 / 化学伝達 / トランスポーター |
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| Research Abstract |
【１】Cl-とケトン体結合部位の同定：VGLUTについて、次の2つを実施した。
（１）３D構造上、Arg184の近傍に位置する10箇所のアミノ酸残基のアラニン置換体と、ループ領域内の10箇所のアラニン置換体を調製した。これまでに、グルタミン酸輸送におけるCl-とケトン体・グリオキシル酸による影響を半数のVGLUT変異体で測定した。（２）調製した高純度VGLUT2タンパク質とHPLCならびに質量分析計を用い、Cl-並びにケトン体・グリオキシル酸でブロックされるDIDSの結合部位を化学修飾法により決定することを試みている。
【２】アロステリック効果による構造変化とモノマー／オリゴマー変換の実証
N末端領域に蛍光性タンパク質AmCyanあるいはEYFPを融合したβ-EYFP-VGLUT-αまたはβ-AmCyan-VGLUTαを調製し、モノ・オリゴマー変換をFRETにより測定した。
【３】 細菌ホモログ・トランスポーターの結晶構造解明（アニオン・スイッチの構造解明）細菌ホモログの基質結合型・非結合型・アニオン結合型の３つの構造の比較から、アニオン結合部位・基質結合部位の構造を決定する。
【４】ケミカルバイオロジー手法・ケモインフォマティックス手法による制御剤リード化合物の設計・合成・評価した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
【１】ー（１）については、作成した２０個の変異体のうち半分の活性を調べ、その内１種にCl-による活性活性化効果が弱い物をみつけた。
（２）については、質量分析により、VGLUT2の膜貫通領域を含む全体の60％のペプチドを同定することが可能となった。この測定系によりDIDS結合部位と思われるペプチドを同定した。
【２】N末端領域に蛍光性タンパク質AmCyanあるいはEYFPを融合したβ-EYFP-VGLUT-α及びβ-AmCyan-VGLUTαを調製し、FRET測定を行ったところ、FRETを観察した。FRETの結果より、少なくともVGLUT2は三量体以上を形成していることが明らかとなった。
【３】 細菌ホモログ・トランスポーター（基質非結合型）の結晶構造を４オングストロームの解像度で解明した。
【４】グリオキシル酸の構造類似体を１０種もちい、特に、神経からのグルタミン酸の量子分泌に対する効果を測定した。グリオキシル酸より十倍程度強力なものを見いだしている。
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| Strategy for Future Research Activity |
計画にそって実施する。
【１】ー（１）については残りの変異体の解析を進める。また見いだしたCl-効果が変動する変異体近傍にさらに変異を導入し、その効果も調べる。
（２）質量分析計による測定法が確立できたことから、変異体の解析とあわせ、まずDIDS結合部位を決定する。
【２】モノ・オリゴマー変換を基質や阻害剤存在化で行う。また電子顕微鏡で観察する。
【３】また、解像度が低いので、少なくとも３．５オングストローム程度の解像度となる結晶を調製する。アニオン結合型も解析する。
【４】については、量子放出効果と輸送活性阻害効果との対応を調べる。また、VGLUT2のホモログであるvesicular nucleotide transporter VNUTの特異的阻害剤を開発する。
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[Journal Article] Evaluation of the potency of telaprevir and its metabolites as inhibitors of renal organic cation transporters, a potential mechanism for elevation of serum creatinine.2013
Author(s)
Nakada T, Kito T, Inoue K, Masuda S, Inui KI, Matsubara K, Moriyama Y, Hisanaga N, Adachi Y, Suzuki M, Yamada I, Kusuhara H.
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Journal Title
Drug Metab Pharmacokinet.
Volume: -
Pages: -
Peer Reviewed
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