2015 Fiscal Year Annual Research Report
抗ウイルス状態の誘導を増強する新たな転写後制御メカニズム
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25253030
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
高岡 晃教 北海道大学, 遺伝子病制御研究所, 教授 (30323611)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 自然免疫 / ウイルス感染 / 抗ウイルス効果 / RNAサイレンシング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々はこれまで行ってきた自然免疫研究の成果を生かし，感染防御機構の分子メカニズムを明らかにすることで，ウイルス感染のコントロールにつながる新しい切り口を見出したいと考えて研究を行っている. これまで我々は，ポリADP-riboseポリメラーゼ スーパーファミリーに属するPARP-13のshort isoformであるZAPS（ZAP, short form）が，ウイルス認識に関与する重要な細胞質RNAセンサーであるRIG-Iと会合することを見出し，ZAPSはRIG-I及び下流のシグナル経路の活性化を強力に誘導する正の制御因子であることを明らかにした．
ZAPSによる自然免疫防御機構をさらに解析する過程で，ZAPSはRIG-Iシグナルでの役割以外に，RNAサイレンシングの制御因子として機能する可能性が示唆された．そこで，我々はウイルス感染防御の今までに無いメカニズムとして，ZAPSを基軸としたRNAサイレンシングの脱制御による“antiviral transcriptome”の活性化という新たな概念を提示したいと考えている．さらに，ウイルス感染以外の刺激やストレスに対する細胞応答時に作動するRNAサイレンシング制御因子をZAPS以外にも探索し，様々な“sub-transcriptome”の存在を追求したい．これまで細胞応答のタンパク質発現誘導の根幹としての従来の転写因子による制御とは全く異なる，特定のサブセットのタンパク質の発現増強に関わる新しい転写後制御機構として，その普遍的な役割の可能性を証明したい．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ZAPSに結合するmRNAをRNA immunorecipitation assayを用いて検討し，Zinc finger領域がRNA結合性に関与することを明らかにした．一方で，ZAPSはRIG-I-MAVSシグナル伝達経路を介して，定常状態においても非常に微量なIFN産生に関与することが分かり，この構成的なIFNによるIFNシグナルがInterferon-stimulated genes (ISGs)の発現に影響する可能性が考えられた．そこでこの構成的なIFNによるISGs産生と，ZAPSによるRIG-I-MAVS経路活性化の影響を排除するためCrispr-Cas9システムを用いて，ヒトのMAVS欠損細胞を樹立した．MAVS欠損細胞にZAPS特異的なsiRNAを用いてZAPSを抑制し，IFNシグナル下流で発現する ISGsにZAPSがどのように関与するかについて定量的RT-PCR法により調べた．ZAPSをノックダウンするとIFN-β処理８時間後に誘導されるVIPERN, MX1, OAS2, ISG15などのISGs mRNAは減少することが分かった．Western blot解析によりVIPERINおよびMX1のタンパクも減少することを明らかにした．一方で，各種ISGsのプロモーター領域をクローニングし，Luciferase assayを行ったところ，ZAPSのノックダウンによってプロモーター活性は低下しなかったことから，ZAPSは転写以降のステップに作用している事が考えられた．今後，特異的なISGsがZAPSによってどのようにmRNAの発現を制御するのかについて解明していきたい．また， ZAPS以外のポリADPリボースポリメラーゼスーパーファミリーメンバーや，ZAPSに結合する蛋白が，自然免疫シグナルにおいてどのような役割を担っているかについて検討をすすめている．
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| Strategy for Future Research Activity |
来年度はインターフェロン(IFN)下流で誘導されるInterferon-stimulated genes(ISGs) の発現制御にZAPSの詳細な作用機序について明らかにしたい．そこで下記のような実験を計画した．
(1) ZAPSがmRNAの安定性にあたる影響について．ZAPSがISGs mRNAの安定性に関与するかについて，アクチノマイシンDを用いた定量的RT-PCR法により検討する．またBRIC assayを使用してmRNAの安定性について検証したい．一方でISGs mRNAのクローニングを行いた過剰発現系や，レポーターベクターを用いたluciferase assayによりmRNAの配列との関連性について検討したい．(2) ZAPSがmRNAの核外輸送に与える影響について．ZAPSがmRNAの核外輸送に影響するかについて，細胞を核と細胞質に分画し，それぞれの画分から抽出されるRNAを 定量的RT-PCR法により測定することでZAPSがmRNAの核外輸送に関与しているのかについて調べる．(3) ZAPSがmRNAのスプライシングに与える影響について．ZAPSがmRNAのスプライシングに関与するのかについて，スプライソソームとの会合や局在性を検証したい．また複数のイントロンを持つISGs mRNAと持たないISGs mRNAに対する影響性について定量的RT-PCR法により検証する予定である．
これらの課題を，ZAPS特異的なsiRNAを用いた実験や， RNA との会合に必要な領域のdeletion mutants を作製しているので，この発現ベクターを用いた実験系で解析をする予定である．また ZAPS以外のPARPファミリーメンバーが，これらの制御にどのように関与しているかについても検討をすすめたい．
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[Journal Article] Superoxide Dismutase 1 Protects Hepatocytes from Type I Interferon-Driven Oxidative Damage.2015
Author(s)
Bhattacharya A, Hegazy AN, Deigendesch N, Kosack L, Cupovic J, Kandasamy RK, Hildebrandt A, Merkler D, Kühl AA, Vilagos B, Schliehe C, Panse I, Khamina K, Baazim H, Arnold I, Flatz L, Xu HC, Lang PA, Aderem A, Takaoka A, Superti-Furga G, Colinge J, Ludewig B, Löhning M, Bergthaler A.
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Journal Title
Immunity
Volume: 43
Pages: 974-986
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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