ALSの発症に関わるADAR2遺伝子発現異常を引き起こす分子病態の解析

2013 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 25253063
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 郭 伸 東京大学, 医学(系)研究科(研究院), 客員研究員 (40160981)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: RNA編集 / 筋萎縮性側索硬化症 / アデノシンデアミナーゼ / 遺伝子 / 転写因子

Research Abstract

孤発性筋萎縮性側索硬化症（ALS）患者の運動ニューロンでは、グルタミン酸受容体であるAMPA受容体サブユニットGluA2のRNA編集効率が低下している。この分子変化は未編集型GluA2をサブユニットにもつAMPA受容体からのCa2+流入増大を通じて運動ニューロン死を引き起こすことが分子病態モデルマウスの解析から明らかになった。この分子異常は専らRNA編集酵素 adenosine deaminase acting on RNA 2 (ADAR2)の 発現が進行性に低下することに依るため、ヒトADAR2遺伝子ADARB1の発現制御機構を明らかにする必要がある。そのためADARB1遺伝子発現に関わる転写因子・制御因子の同定を目的とする。
ADARB1遺伝子open reading frame (ORF)の上流3kbp内にプロモーター領域が存在すると考え、この想定プロモーター領域3kbpの下流にルシフェラーゼ遺伝子を繋いだコンストラクトを作成し、このコンストラクトをstableに発現するルシフェラーゼレポーターアッセイ系をHeLa細胞を用いて構築した。
上記の想定プロモーター領域をデータベース上で検索し、ヒストン修飾、DNaseI感受性などから、ヒトADAR2遺伝子プロモーター領域を絞り込み、そこに結合する転写因子候補を特定した。
上記の候補転写因子群および既報のALS運動ニューロンで変化していると報告されている転写因子につき、作成したレポーターアッセイ系およびsiRNAを用いたノックダウンによりADARB1遺伝子の発現に影響を及ぼす転写因子候補を検索した。
これらの実験から、候補転写因子1種（TF-X）を特定することができた。複数の転写因子が共同してADARB1遺伝子の発現制御に関わっている可能性が高いので、TF-Xと共同して働く候補転写因子群の検索を更に進める。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ADARB1遺伝子制御メカニズムを解析するためのレポーターアッセイ系を培養細胞系を用いて構築した。このレポーターアッセイ系および培養細胞を用いた遺伝子発現への調節作用の検討から、ADARB1遺伝子発現制御に関わる転写因子候補の絞り込みが進んでいる。

Strategy for Future Research Activity

最近データが新たに加わってきたウェブ上の遺伝子情報を活用して、遺伝子発現に関わる転写因子、プロモーター、エンハンサー部位の特定を更に進める。複数の転写因子の関与が想定されるため、既に特定したTF-Xに加え、複数の転写因子による遺伝子制御機構を培養細胞系で確認する。更に、ADARB1遺伝子への結合部位を特定し転写因子の作用部位を明らかにしていく。

Research Products

• [Journal Article] Unique nuclear vacuoles in motor neurons of conditional ADAR2-knockout mice. (2014)
  • Author(s): Sasaki, S., Yamashita, T., Hideyama T, Kwak, S.
  • Journal Title: Brain Res. Volume: 1550 Pages: 36-46
  • DOI: 10.1016/j.brainres.2014.01.006.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The molecular link between inefficient GluA2 Q/R site-RNA editing and TDP-43 pathology in motor neurons of sporadic amyotrophic lateral sclerosis patients. (2014)
  • Author(s): Yamashita, T., and Kwak, S.
  • Journal Title: Brain Res. Volume: in press. Pages: .
  • DOI: 10.1016/j.brainres.2013.12.011.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Genetic and epigenetic studies of amhyotrophic lateral sclerosis. (2013)
  • Author(s): Al-Chalabi, A., Kwak, S., Mehler, M., Rouleau, G., Siddique, T., Strong, M., Leigh, PN.
  • Journal Title: Amyotroph Lateral Scler Frontotemporal Degener Volume: 14 Pages: 44-52
  • DOI: 10.3109/21678421.2013.778571.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Rescue of amyotrophic lateral sclerosis phenotype in a mouse model by intravenous AAV9-ADAR2 delivery to motor neurons. (2013)
  • Author(s): Yamashita, T., Chai, H., Teramoto, S., Tsuji, S., Shimazaki, K., Muramatsu, S., Kwak, S.
  • Journal Title: EMBO Mol Med Volume: 5 Pages: 1710-1719
  • DOI: 10.1002/emmm.201302935.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A unique mouse model for investigating the properties of amyotrophic lateral sclerosis-associated protein TDP-43, by in utero electroporation. (2013)
  • Author(s): Akamatsu, M., Takuma, H., Yamashita, T., Okada, T., Keino-Masu, K., Kazuhiro, Ishii K., Kwak, S., Masu, M., Tamaoka, S.
  • Journal Title: Neurosci Res. Volume: 77 Pages: 234-241
  • DOI: 10.1016/j.neures.2013.09.009.
  • Peer Reviewed
• [Presentation] A step for mechanism-based ALS therapy. International symposium “New Frontier of Molecular Neuropathology 2014” (2014)
  • Author(s): Kwak, S.
  • Organizer: CREST-新学術共催国際シンポジウム
  • Place of Presentation: 東京、日本
  • Year and Date: 20140316-20140317
  • Invited
• [Presentation] Calpain-dependent cleavage of TDP-43 plays a crucial role in ALS pathology. (2013)
  • Author(s): Yamashita, T., Hideyama, T., Teramoto, S., Takano, J., Iwata, N., Saido, TC., Kwak, S.
  • Organizer: The 44th Annual Meeting Society for Neuroscience
  • Place of Presentation: San Diego, USA
  • Year and Date: 20131109-20131113
• [Presentation] ADAR2-dependent death and TDP-43 mislocalization in motor neurons. (2013)
  • Author(s): Kwak, S., Yamashita. T., Teramoto, S., Chai, HL.
  • Organizer: 8th Brain Research conference “RNA binding proteins in neurological disease”
  • Place of Presentation: San Diego, USA
  • Year and Date: 20131107-20131108
• [Presentation] Calpain-dependent cleavage of TDP-43 plays a crucial role in ALS pathology. (2013)
  • Author(s): Yamashita, T., Hideyama, T., Teramoto, S., Takano, J., Iwata, N., Saido, TC., Kwak, S.
  • Organizer: 8th Brain Research conference “RNA binding proteins in neurological disease”
  • Place of Presentation: San Diego, USA
  • Year and Date: 20131107-20131108
• [Presentation] Calpain cleavage of TDP-43 in amyotrophic lateral sclerosis. Biology of Clpains in Health and Disease. (2013)
  • Author(s): Kwak, S.
  • Organizer: Science Research Conferences FASEB
  • Place of Presentation: Saxtons River, Vermont,USA
  • Year and Date: 20130721-20130726
  • Invited
• [Presentation] ClapainがALSのTDP-43病理形成に果たす役割 (2013)
  • Author(s): 山下雄也、日出山拓人、寺本さやか、高野二郎、岩田修永、西道隆臣、郭 伸
  • Organizer: 第35回神経組織培養研究会
  • Place of Presentation: 大阪、日本
  • Year and Date: 20130629-20130630
• [Presentation] ClapainがALSのTDP-43病理形成に重要な役割を果たす (2013)
  • Author(s): 山下雄也、日出山拓人、寺本さやか、高野二郎、岩田修永、西道隆臣、郭 伸
  • Organizer: 第36回日本神経科学大会Neuro2013
  • Place of Presentation: 京都、日本
  • Year and Date: 20130620-20130623
• [Presentation] AMPA receptor-mediated activation of calpain triggers TDP-43 pathology in ALS by cleaving TDP-43 into aggregation-prone fragments. (2013)
  • Author(s): Kwak, S.
  • Organizer: GRC Calcium signaling
  • Place of Presentation: Lucca, Italy
  • Year and Date: 20130616-20130621
• [Presentation] Molecular mechanism generating TDP-43 pathology in amyotrophic lateral sclerosis (ALS) motor neurones. (2013)
  • Author(s): Kwak, S., Yamashita, T., Hideyama, T., Teramoto, S.
  • Organizer: The 23rd Meeting of the European Neurological Society.
  • Place of Presentation: Balcerona, Spain
  • Year and Date: 20130608-20130611
• [Presentation] AMPA受容体サブユニットGluA2のQ/R 部位RNA編集率に対する薬剤の効果 (2013)
  • Author(s): 澤田準、相澤仁志、淺野目明日香、高橋佳恵、斉藤司、片山隆行、長谷部直幸、山下雄也、郭 伸
  • Organizer: 第54回日本神経学会学術大会
  • Place of Presentation: 東京、日本
  • Year and Date: 20130530-20130601
• [Presentation] マウス胎仔電気穿孔法によるin vivo TDP-43遺伝子導入と封入体形成の検討 (2013)
  • Author(s): 詫間浩、赤松恵、山下雄也、岡田拓也、石井一弘、桝和子、郭 伸、桝正幸、玉岡晃
  • Organizer: 第54回日本神経学会学術大会
  • Place of Presentation: 東京、日本
  • Year and Date: 20130530-20130601
• [Book] 医学の歩み 247 (2013)
  • Author(s): 山下雄也、郭 伸
  • Total Pages: 9
  • Publisher: 医歯薬出版
• [Book] シリーズ＜アクチュアル脳・神経疾患の臨床＞ (2013)
  • Author(s): 郭 伸
  • Total Pages: 10
  • Publisher: 中山書店
• [Remarks] 東京大学大学院医学系研究科 疾患生命工学センター 臨床医工学部門 郭研究室
  • URL: http://square.umin.ac.jp/teamkwak