2014 Fiscal Year Annual Research Report
湖沼および海洋におけるツボカビの多様性と機能評価：検出方法の開発と物質流の定量化
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25281012
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| Research Institution | Toho University |
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Principal Investigator |
鏡味 麻衣子 東邦大学, 理学部, 准教授 (20449250)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
出川 洋介 筑波大学, 生命環境科学研究科(系), 助教 (00311431)
伴 修平 滋賀県立大学, 環境科学部, 教授 (50238234)
浜口 昌巳 独立行政法人水産総合研究センター, 瀬戸内海区水産研究所, 主幹研究員 (60371960)
細井 祥子(田辺祥子) 滋賀県立大学, 環境科学部, 助教 (80423226)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 物質循環 / 生物多様性 / 湖沼 / 微生物 / 生態学 / 環境 / 琵琶湖 / 印旛沼 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成26年度は、①水圏のツボカビの多様性評価、②ツボカビの検出・定量方法の開発、③ツボカビを介した物質流Mycoloopの定量化、に取り組んだ。
目的①については、平成25年度に開発した微量DNA解析方法を適用し、印旛沼や琵琶湖で昨年度に引き続き新しい系統を発見した。複数の単離培養株を得られる事ができ、珪藻に寄生するツボカビについては電子顕微鏡による形態観察を行い、新種や新属の発見と言えそうな結果が得られている。東京湾に関しては、表層中にもCryptomycotaなどの真菌類がいることは明らかとなったが、ツボカビは検出されなかった。ただし、DNA解析だけでは多様性が把握できない可能性が高いため、今後は次世代シークエンサーの活用を視野にいれ取り組んで行く予定である。
目的②については、FISH法によるツボカビの検出方法を検討した結果、そもそも染色が難しい事が判明した。また定量PCR法に関しても、ツボカビ全般を検出するプライマーやプローブの設計は難しい事が明らかとなった。ツボカビの種特異的な検出・定量を試みるか、別の手法を開発する必要がある。モノクローナル抗体については、単離できたツボカビについては作成を進めており、今後は野外での適用可能性について検討する。
目的③については、花粉ーツボカビーミジンコという流れ(第２のMycoloop)を培養実験で検討したものについて、ツボカビの質(CNP,脂肪酸組成）や生態転換効率を求め、再解析を行った。植物プランクトンーツボカビーミジンコの流れについては、ミジンコの消化管内のツボカビのDNAを検出する方法を開発したが、論文を投稿したところプライマーの特異性についての問題を指摘され再度開発したプライマーで実験を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、次の４つの課題に取り組んでいる。①ツボカビの形態分類とDNAシークエンス情報を完全に一致させたデータベースを構築し、これまで見過ごされてきた水圏のツボカビの多様性を評価する。②モノクローナル抗体と定量PCR法、FISH法を用いたツボカビの検出・定量方法を世界に先駆けて開発する。③開発した定量方法と、元素安定同位体分析、操作培養実験により、ツボカビを介した物質流Mycoloopの野外における重要性を定量的に評価する。④これらの成果をまとめてツボカビを多様性と機能を考慮にいれた水圏の物質循環モデルを提示する。
目的①については、新しい系統も発見し、単離培養できた系統については、電子顕微鏡による形態分類とDNA解析による分子系等解析を一致させる事ができた。微量DNA解析手法については、論文が受理された。東京湾については、DNA解析だけではツボカビの多様性が把握できない可能性が明らかとなったため、平成27年度は単離培養や次世代シークエンサーの活用を視野にいれ取り組んで行く予定である。
目的②については、FISH法や定量PCR法では色々と難しい点があるため、モノクローナル抗体など別の方法を探る予定である。
目的③については、花粉ーツボカビーミジンコという流れ(第２のMycoloop)の培養実験を投稿予定であったが、再解析を行ったため、当初の予定より遅れ平成27年度に投稿する予定である。植物プランクトンーツボカビーミジンコの流れについては、ミジンコの消化管内のツボカビを検出する方法を開発し、投稿した論文の修正を行った。
以上のように、計画以上に進展している項目もあれば、方法的に困難である事が判明し手法を見直している項目もあり、おおむね順調に進展しているといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
目的①のツボカビの多様性評価については、今後も引き続き微量DNA解析による新規系統の発見や単離培養と形態観察による形態分類を行う。また順調にデータベースが構築できているため、次世代シークエンサーの活用を視野にいれ網羅的解析を試みたい。
目的②のツボカビの定量方法の開発については、FISH法や定量PCR法では色々と難しい点があるため、その点の克服先を引き続き探るとともに、モノクローナル抗体など別の方法を探る予定である。
目的③のツボカビを介した物質流の定量化については、これまでの成果をまとめると共に、野外での定量化を視野に入れた方法の検討を行う。
目的④のツボカビを考慮に入れた物質循環モデルの提示については、既に公表したモデルを用いた解析にくわえ、新しいモデルの提示についても検討を行う。
最終年度となるため、これまでの成果を投稿論文にまとめるとともに、総合的な討論を、ワークショップやモデル開発、総説の発表などを通じて行う。
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| Causes of Carryover |
試料からのDNA抽出やクローニングが予定よりもうまくいかなかったため、シークエンス委託する試料数が少なくなり、次年度使用することとした。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成27年度のシークエンス委託費として用いる。
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Research Products
(11 results)
