2015 Fiscal Year Annual Research Report
遺伝毒性物質の経世代的影響の定量的評価法に関する研究
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25281027
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| Research Institution | National Institute of Health Sciences |
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Principal Investigator |
増村 健一 国立医薬品食品衛生研究所, 変異遺伝部, 室長 (40291116)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 遺伝毒性 / ゲノム / 次世代影響 / 遺伝子突然変異 / トランスジェニックマウス遺伝子突然変異試験 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
遺伝毒性発がん物質の作用には閾値がないものとされているが、実際にヒトが曝露される低用量域においては、生体防御機構により遺伝毒性が抑制される可能性が考えられる。環境化学物質の遺伝毒性リスクに関して、生殖細胞および経世代の遺伝的影響の特徴は明らかでない。本研究では、変異検出用レポーター遺伝子導入トランスジェニックマウスと次世代シークエンシング(NGS)技術を用いて、遺伝毒性の次世代個体への影響を評価する。
次世代突然変異の用量反応関係の検討を行うため、雄gpt deltaマウスにENUを85, 30, 10 mg/kg b.w.の用量で週1×2回腹腔内投与し、投与後10週目から無処理雌マウスと交配してF1個体を得た。父マウスの肝臓、精巣および精巣上体、母および子マウスの肝臓をサンプリングした。各用量群1家族単位（両親と子4匹の計6匹）について全エキソン領域のNGS解析を行った。全4家族（高・中・低用量ENU投与群および対照群）計24個体について肝臓からDNAを抽出し、エキソーム解析を行った。得られたリード配列をC57BL/6マウスの参照配列にマッピングし、一塩基多型の検出(SNVs)を行った。検出されたSNVsから親子間比較によって子に新たに生じた変異候補を抽出した。研究成果の一部を日本環境変異原学会第44回大会および米国Society of Toxicology 55th Annual meetingにおいて発表した。
また、体細胞及び生殖細胞における遺伝子突然変異頻度の用量反応データを得るため、3用量のENUを投与した雄gpt deltaマウスの肝臓、精巣および精子からゲノムDNAを抽出し、gptアッセイにより点突然変異体頻度を測定した（次年度も継続）。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昨年度までに高用量ENU投与群の子において次世代突然変異頻度の顕著な増加を検出することができた。ENU誘発次世代変異スペクトルは体細胞変異スペクトルと共通した特徴を示しており、本検出法の妥当性が示唆された。今年度は、NGS解析による次世代変異検出法の再現性と実用性を検証するため、そして次世代変異の用量反応データを得るために、3用量のENUを投与した雄由来の家族サンプルを用いて全エキソーム解析を実施した。4家族24個体の全エキソームデータを取得し、トリオ解析を行った結果、子に新たに生じた変異数はENU投与の用量依存的に増加した。これは、今回用いた次世代変異検出法の有効性を示唆している。さらに、サンガー法を用いた変異候補の確認結果から偽陽性の特徴を分析し、NGSデータのみで効率的に変異を絞り込む条件を検討している。陰性対照群においては変異頻度が低く変異候補が得られないことなど、エキソーム解析での検出力を評価する上での重要な情報が得られている。
また、ENU投与個体の体細胞および生殖細胞における遺伝子突然変異頻度の用量反応データを得るため、gptアッセイを実施し点突然変異頻度の測定を進めている（次年度も継続）。これによって、遺伝毒性物質が誘発する遺伝子突然変異を親個体の体細胞と生殖細胞および次世代個体で量的に比較することが可能になる。
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| Strategy for Future Research Activity |
全4家族（高・中・低用量ENUおよび対照群）の全エキソン配列データを用いて変異検出および次世代変異頻度の算出を行い、次世代突然変異の用量反応曲線を作成する。前年度までのデータと比較し、解析個体数の影響やバックグラウンド変異の低減化など、NGS解析による変異検出法の条件検討を行う。マッピングおよび変異検出に使用するプログラムの違いによる影響を検討する。変異リード数の評価を用いた疑陽性の低減法を導入する。必要に応じて、サンガー法による確認も実施する。
ENUを投与した雄親個体を用いて、体細胞と生殖細胞における突然変異の測定を行う。体細胞変異頻度の測定には肝臓DNA、生殖細胞変異頻度の測定には精巣および精子DNAを用いる。gptアッセイを行い、点突然変異頻度を算出してそれぞれの用量反応曲線を作成する。
これらのデータをまとめ、遺伝毒性物質に曝露された個体の体細胞と生殖細胞における突然変異誘発性の感受性の違いを検討する。体細胞および生殖細胞における変異原性と次世代個体ゲノム変異との相関について検討する。次世代変異の定量的評価を通じて遺伝毒性の次世代影響と生体防御機構の関与について考察する。
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| Causes of Carryover |
本研究では次世代DNAシークエンサーによって得られたデータの情報解析および突然変異部位の塩基配列解析を実施する費用を計上している。今年度までに得られた結果を受けて追加の情報解析を予定しており、次年度に約60万円の解析費用が見込まれるため、次年度使用額とする。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
前年度までに実施した次世代DNAシークエンサーを用いた塩基配列解析および変異検出の結果を精査し、変異候補の効率的な絞り込みのための追加条件検討を行う。情報解析に約60万円を充当する計画である。
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[Presentation] Sensitivity of inactivated DNA polymerase kappa knock-in mice to mitomycin C2015
Author(s)
Takeiri A, Naoko AW, Motoyama S, Matsuzaki K, Tateishi H, Matsumoto K, Niimi N, Sassa A, Grúz P, Masumura K, Yamada M, Mishima M, Jishage K, Nohmi T
Organizer
The 7th International Congress of Asian Society of Toxicology
Place of Presentation
International Convention Center Jeju Island, South Korea
Year and Date
2015-06-23 – 2015-06-26
Int'l Joint Research
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