2013 Fiscal Year Annual Research Report

体液Na+恒常性を維持する腸管Na+リサイクリング制御システムの分子基盤の解明

Research Project

Project/Area Number	25282024
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
Research Institution	University of Shizuoka
Principal Investigator	林久由静岡県立大学, 食品栄養科学部, 准教授 (40238118)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	五十里彰岐阜薬科大学, 薬学部, 教授 (50315850)
Project Period (FY)	2013-04-01 – 2017-03-31
Keywords	タイト結合 / クロージン / NHE3 / Na+依存性栄養素吸収
Research Abstract	タイト結合のイオン透過性を制御している分子実体を同定する為に、cAMP刺激によるCl-分泌時の経上皮抵抗の増加の際にタイト結合構成タンパク質であるクロージンが関与するか否かを検討した。野生型マウス(WT)、Claudin-2 KOマウス(Cldn2-/-)、Claudin-15 KOマウス(Cldn15-/-)の小腸を用いて、Ussing Chamber法にて経上皮の短絡電流(Isc)及び電気的コンダクタンス(Gt)を測定した。WT、Cldn2-/-においてはcAMPで刺激では、Isc上昇に相反してGtの低下が観察された。しかし、Cldn15-/-では、Isc上昇は観察されたが、Gt低下は観察されなく、Claudin 15がcAMPにより調節されている可能性が示唆された。Claudin 15を安定発現する細胞系を樹立し、cAMP刺激時の細胞内局在への影響を検討したが細胞内局在の変化は観察されなかった。WTでCl-分泌抑制下でcAMP刺激を行うとGt低下は観察されず、Gt低下は細胞間隙の圧排によることが示唆された。またCldn15-/-を用いて、cAMP刺激によりタイト結合のイオン選択性が変化するか否かを検討したところ、陽イオン選択性の増加が観察されたが、分子実体の同定には至っていない。また腸管Na+代謝と栄養素吸収機構の関連を評価する為に、Cldn15-/-を用いてペプチド吸収機構をWTマウスと比較検討した。In vivoでペプチド(Gly-Sar)吸収速度を比較すると、WTマウスでは上部空腸で高いGly-Sar吸収速度が観察されたが、Cldn15-/-では大きく抑制されていた。ペプチド誘発短絡電流を測定すると、WTではプラトー相が観察されたが、Cldn15-/-では一過性の上昇が観察され、ペプチド吸収の駆動力の維持機構の低下が示唆された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason Na+依存性栄養素吸収により体循環に入るNa+ 吸収量と電気的中性の機構を介し体循環に入るNa+吸収量をマウスの小腸で測定し、その量的関係、並びに相互作用を明らかにすることが、当初の実験計画にあった。当初の計画では電気的中性の機構のNa+ 吸収量を評価する為には主要なNa+ 吸収輸送体であるNHE3を欠損したマウスを搬入し、野生型マウスと比較し、検討を行う予定であった。しかし遺伝子組換え実験動物施設の故障と搬入スペースの問題があり、現時点ではNHE3ノックアウトマウスの搬入の目途は立っていない。このため本年度では、NHE3の特異的抑制剤を用いて、Na+依存性栄養素吸収により体循環に入るNa+ 吸収量と電気的中性の機構を介し体循環に入るNa+吸収量の量的関係を明らかにする。タイト結合のイオン透過性を制御しているクロージンの分子実体を同定することに関しては、クロージン15ノックアウトマウスではcAMP刺激では野生型に比べ、Gt低下は観察されず、クロージン15がタイト結合の透過性調節に寄与することが示唆された。しかし、クロージン15発現系ではcAMP刺激ではコンダクタンス変化や、イオン選択性の変化は観察され無かったが、小腸上皮細胞のタイト結合の直下に形成されている細胞間隙の形成に重要であることが示唆され、細胞間隙の生理的役割等の今後の検討が必要である。またクロージン15ノックアウトマウスでは腸管Na+代謝の変化に伴い、ペプチド吸収機構が低下していることが明らかになった。
Strategy for Future Research Activity	現時点でNHE3ノックアウトマウスの搬入の目途は立っていないため、本年度は、NHE3の特異的抑制剤S3226を用いて、Na+依存性栄養素吸収により体循環に入るNa+ 吸収量と電気的中性の機構を介し体循環に入るNa+吸収量の量的関係を明らかにする。最初に主要なNaCl吸収部位を同定する為にリアルタイムPCR法を用いて、NHE3並びにその制御タンパク質であるNHERF(NHE regulatory factor)の発現量を腸管の各部位で調べる。またマウスに低Na+食を摂食させ、腸管の各部位でNHE3等の発現量が変化するか観察する。変化が観察された腸管部位で実際にNa+吸収が亢進しているかどうかはユッシングチャンバー法でラジオアイソトープである22Na+の経上皮フラックスを測定することで行う。Na+依存性栄養素吸収により体循環に入るNa+ 吸収量と電気的中性の機構を介し体循環に入るNa+吸収量の量的関係に関しては、麻酔下のマウスに22Na+を含むグルコースを胃内投与し、血糖値上昇と22Na+の血液中の濃度増加速度を測定する。この際にグルコース量、NaCl量を変化させ量的関係を検討する。またNa依存性ではない促進拡散で吸収されるフルクトースやNHE3の特異的抑制剤であるS3226を添加した際に、どのように血中濃度上昇が変化するかを観察することにより、Na+依存性栄養素吸収と電気的中性のNa+吸収機構の関連を明らかにする。また同様の実験をNa+リサイクリング機構が機能していないクロージン15ノックアウトマウスで行う。