2013 Fiscal Year Annual Research Report
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25282133
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
宮崎 浩 大阪大学, 基礎工学研究科, 准教授 (00263228)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 細胞 / 細胞核 / 形態 / 力学的特性 / 力学場 |
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| Research Abstract |
本研究では，細胞および細胞核の形態と構造の計測を行うとともに，力学試験によって一細胞個体において細胞と細胞核の力学的特性を詳細に計測し，細胞および細胞核の形態・構造と細胞核の力学的特性との関係を明らかにし，さらに，細胞核の置かれた力学場を定量的に明らかにすることを目的としている。
1) 細胞・細胞核用引張・圧縮試験装置の改良
今年度は，まず，力学試験後の細胞から単離した細胞核を捕捉してその力学試験を行うまでのプロセスの改良に着手した。購入した光ピンセット装置とXY自動ステージを顕微鏡に組み込み，これらを用いて，核単離液の灌流により細胞から単離した細胞核を非接触で捕捉し，特定の細胞核の位置操作を行うことに成功した。しかし，核単離液から試験用溶液への溶液交換の際に生じる液流によって，細胞核がレーザトラップから外れて流失してしまう問題が生じた。これを解決するために，溶液交換法および単離細胞核を一時的に格納するマイクロピペットの併用などを検討し，単離細胞核の確保から力学試験に至るプロセスの確立を行っている。
2) マイクロピペット吸引試験のための準備
細胞およびその細胞個体から単離した細胞核のマイクロピペット吸引試験を行うために，顕微鏡にマイクロピペット吸引試験装置の組み込みと調整を行った。直径5マイクロメートルのピペットを使用して，200 Paまでの一定の吸引圧で細胞のマイクロピペット吸引試験が可能となった。また，この装置を細胞引張・圧縮試験における細胞核の一時格納に利用することを試みている。単離細胞核の蛍光観察を行うための蛍光装置の導入を行い，青色から赤色までの蛍光観察を行えるようにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
今年度は，力学試験後の細胞個体から単離した細胞核を捕捉し，引き続きその細胞核の力学試験を行うまで保持しておくための光ピンセット装置を，現有の細胞用引張・圧縮試験装置に組み込んで使用可能にすることが大きな目的の一つであった。しかし，細胞核が直径10マイクロメートルと大きいことから，溶液交換時の液流の影響を大きく受けて，流体力がレーザトラップの捕捉力を上回って細胞核が流失してしまい，力学試験まで細胞核を保持し続けることが困難であった。レーザの出力を高めると細胞核が損傷を受ける危険があることから，現在，溶液灌流法の改善や光ピンセットと細胞核一時確保用のマイクロピペットの併用を試みている段階である。装置の導入と組み込みは予定通り実施出来たが，一連の試験法を確立するまでに至らなかった。
また，原子間力顕微鏡（AFM）を用いた細胞および細胞核の微小硬さ試験を行う予定であったが，装置が故障し，また修理費用が非常に高額であるため今年度の実施は断念した。
顕微鏡へのマイクロピペット吸引試験装置の組み込みと調整は予定通り進んでいる。水を入れたリザーバーの高さをマイクロメーターヘッドで微調整することによって，任意に設定した200 Paまでの一定の吸引圧を細胞に作用させて，マイクロピペット吸引試験行うことが可能であることを確認した。
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| Strategy for Future Research Activity |
単一細胞とその細胞の細胞核の力学的特性を詳細に計測する一連の力学試験を行うためには，一細胞個体から単離した細胞核の捕捉と確保を行うことが不可欠である。そのため，まず，この技術の確立を最優先で行っていく。解決すべき最大の問題は，光ピンセットで捕捉した細胞核が試験チャンバーへの溶液の灌流によって流失してしまうことである。細胞核単離液によって細胞から単離した細胞核をまず光ピンセットで捕捉し，それをマイクロピペット内に吸引して一時的に格納しておく。試験用溶液の灌流により核単離液を除去した後，マイクロピペットから細胞核を吐出させて光ピンセットで再度捕捉することにより，細胞核流失問題の解決を図る。
その後，無処理の細胞，およびF-アクチンを薬剤で脱重合させた細胞，ラミンをノックダウンさせた細胞を用いて，単一細胞およびその細胞から単離した細胞核の引張試験と圧縮試験，マイクロピペット吸引試験を行う。これらの試験によって，細胞の力学的特性に対する細胞核の寄与，F-アクチンの発達が細胞核の力学的特性に及ぼす影響を明らかにするとともに，細胞および核の力学的特性に対する核ラミナの寄与を明らかにする。
さらに，力学試験とともに微細構造の蛍光観察を行い，細胞および細胞核の三次元形態・構造・構成要素の分布と力学的特性との関係を明らかにし，形態データと力学データの統合的解析により細胞核内外の力学場を明らかにしていく。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
学術研究助成基金助成金に未使用額が生じた。これは，今年度の研究課題の一部が，解決すべき課題が生じたこと，また，既存の装置の故障により予定通り進まなかったため，全て予定通り遂行出来た場合に要する費用の支出がなかったことによるものである。
次年度は，今年度に生じた課題遂行上の問題点を解決し，研究を進めていく予定であり，そのために必要であるが今年度は購入を見合わせた物品の購入，マイクロマニピュレータなど定期的なメンテナンスが必要な装置類の修理費用，今年度故障した装置の修理費用，予定している研究の推進に必要な機器および消耗品類の購入を行う。また，成果報告および研究調査のために2回の国際会議と数回の国内会議への参加を予定しており，その参加費用に充てる。
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