2015 Fiscal Year Annual Research Report

単一細胞バイオメカニクスと細胞核力学場の解明

Research Project

Project/Area Number	25282133
Research Institution	Osaka University
Principal Investigator	宮崎浩藍野大学, 医療保健学部, 教授 (00263228)
Project Period (FY)	2013-04-01 – 2017-03-31
Keywords	細胞 / 細胞核 / 形態 / 力学的特性 / 力学場
Outline of Annual Research Achievements	本研究では，細胞および細胞核の形態と構造の計測を行うとともに，力学試験によって一細胞個体において細胞と細胞核の力学的特性を詳細に計測し，細胞および細胞核の形態・構造と細胞核の力学的特性との関係を明らかにし，さらに，細胞核の置かれた力学場を明らかにすることを目的としている。研究機関を移ったため，まず，研究機器の移設と細胞・細胞核用力学試験装置の再構成を行い，移設に伴い不調となった機器の修理と調整を行うなど環境を整えた後に課題に取りかかった。 1) 細胞・細胞核用力学試験装置および実験手法の改良と力学試験：　単離細胞核を光ピンセット装置により捕捉できるようになったが，溶液交換の際に流失する問題があった。そこで，溶液交換用ポンプを定常流のシリンジポンプに変更し，さらに，細胞核格納用のマイクロピペットを導入した。単離した細胞核をレーザトラップした後にピペット内に吸引する方法により，成功率は低いものの単離細胞核の確保を行うことができた。しかし，細胞核の単離からマイクロツールでの把持に至る過程の成功率が低く，力学試験の成功には至っていない。 2) F-アクチンを破壊した細胞および単離核の圧縮試験：　蛍光観察に必要な遺伝子の導入を行った線維芽細胞をカバーガラス上で培養し，細胞のF-アクチンを脱重合させる方法と技術は確立したが，力学試験については，上記1) のように試験プロセスの確立が終わっていないためデータ取得に至っていない。 3) 無処理の細胞とF-アクチンを破壊した細胞および単離核のマイクロピペット吸引試験：　無処理の線維芽細胞を使用して，細胞と，その細胞個体から単離した細胞核のマイクロピペット吸引試験を試み，成功率は低いものの数例のデータを得ることができた。しかし，単離細胞核がピペットに接着しやすい問題があるため，ピペットのコーティング法の改善を行っている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason 今年度は，力学試験装置および実験手法を改良し，力学試験後の細胞個体から単離した細胞核を捕捉し，引き続きその細胞核を力学試験用マイクロツールで把持して力学試験を行うための方法を確立し，力学試験のデータを得ることが大きな目的であった。しかし，年度当初に研究機関を移ったために，機器類の解体，運搬，移設が必要となり，また，顕微鏡を設置するスペースの都合から，顕微鏡周辺の装置の配置等を大幅に変更する必要に迫られた。さらに，輸送に伴いいくつかの主要な装置類が不調となったために修理と調整を要するなど，研究環境を整えるために時間を費やし，研究課題の実験開始が大きく後ろにずれ込んだ。昨年度に問題となった，トラップ用レーザが細胞核格納用ピペットにかかると細胞核がトラップから外れてしまうこと，ピペット内に近くの細胞の残骸や細胞核までも吸い込んでしまうことは，試験チャンバー内のスペースを大きく取ること，およびチャンバー内の細胞密度を極めて低くすることによりほぼ解決した。しかし，単離細胞核の格納から圧縮試験用マイクロツールでの把持に至る過程の成功率が低く，引き続き成功率の高い方法の検討を行い，単離細胞核の確保から力学試験に至るプロセスの確立を急いでいる。マイクロピペット吸引試験については，一定の前進をみて力学試験の成功に至ったが，やはり成功率が低いため，方法の改善を行っているところである。
Strategy for Future Research Activity	単一細胞とその細胞の細胞核の力学的特性を詳細に計測する一連の力学試験を行うためには，一細胞個体から単離した細胞核の捕捉と確保を行うことが不可欠である。この細胞核の確保とその後のマイクロツールでの把持の成功率が低いため，引き続き，この技術の確立を最優先で行っていく。細胞核単離液によって細胞から単離した細胞核をまず光ピンセットで捕捉し，それを一時格納用マイクロピペットに吸引して確保する際に，不要な細胞把持用マイクロツールを試験チャンバーの隅に待避させて空間を広く取り，格納用ピペットのアプローチを容易にする。細胞核をピペット内に一時的に格納している間に試験用溶液の灌流を行って試験チャンバー内の核単離液を除去した後，マイクロピペットから細胞核を吐出させて光ピンセットで再度捕捉し，これをマイクロツールで把持することにより問題の解決を図る。方法の確立を行った後，無処理の細胞，およびF-アクチンを薬剤で脱重合させた細胞を用いて，単一細胞およびその細胞から単離した細胞核の圧縮試験，マイクロピペット吸引試験を行う。これらの試験によって，細胞の力学的特性に対する細胞核の寄与，F-アクチンの発達が細胞核の力学的特性に及ぼす影響を明らかにする。さらに，力学試験とともに微細構造の蛍光観察を行い，細胞および細胞核の三次元形態・構造・構成要素の分布と力学的特性との関係を明らかにし，形態データと力学データの統合的解析により細胞核内外の力学場を明らかにしていく。
Causes of Carryover	学術研究助成基金助成金に未使用額が生じた。これは，年度当初に研究機関を移ったために装置類の移設を行い，それに伴って複数の主要な機器に修理と調整が必要になったため，不調が改善されず新たに機器を購入する必要が生じた場合に備えて使用を控えたこと，さらに，研究課題の一部に解決すべき課題が生じたため，全て予定通り遂行出来た場合に要する費用の支出がなかったことによるものである。
Expenditure Plan for Carryover Budget	次年度は，課題遂行上の問題点を解決して研究を進めていく予定であり，そのために，今年度は購入を見合わせたが予定している研究の推進に必要な機器および消耗品類の購入を行う。また，成果報告および研究調査のために国内外の会議への参加を予定しており，その参加費用に充てる。