2014 Fiscal Year Annual Research Report
光酸発生培養基材への精密光照射による接着細胞の物理プロセシング
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25282148
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| Research Institution | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology |
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Principal Investigator |
須丸 公雄 独立行政法人産業技術総合研究所, 幹細胞工学研究センター, 上級主任研究員 (40344436)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
高木 俊之 独立行政法人産業技術総合研究所, 幹細胞工学研究センター, 主任研究員 (10248065)
金森 敏幸 独立行政法人産業技術総合研究所, 幹細胞工学研究センター, チーム長 (50356797)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 細胞操作 / 光酸発生ポリマー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
可視光応答性光酸発生基を側鎖に有するPMMA（pPAGMMA）上への、様々なポリマーのコーティングを検討、細胞単層の切断と局所的な細胞剥離の両方を光照射で誘起可能な基材を、ポリ酢酸ビニル（PVAc）のオーバーコートによって調製する条件を特定した。
この培養基材にMDCK細胞を播種し、緊密な細胞単層をなすまで培養、波長範囲350-450nmの紫外－可視光をグリッドパターンに沿って照射、さらに、波長436nmの青色光照射を、市松模様パターンに沿って照射した。3時間後、グリッドパターンに沿って細胞が死滅・崩壊していること、青色光照射を行った領域においては、細胞単層の浮き上がりを示唆する所見を観察、細胞単層に培地を均一に吹きつけることにより、青色光照射域からのみ細胞単層を剥離・回収することができることが確認された。この青色光も酸発生を誘起するが、低強度で必要十分時間の照射を行うことにより、細胞のviabilityをほとんど損なうことなく、非照射域に対して有意に接着が低減する条件が見出された。同様の光操作は、線維芽細胞であるNIH/3T3に対しても適用できることが確認された。
またpPAGMMAコート表面上に、架橋ヒドロキシプロピルセルロース（HPC）層を形成、20-30%の水を含むエタノール中でパターン光照射を行うことによって、架橋HPC層を選択的に剥離できること、極めて高い阻害／接着コントラストを有するパターニング基材が実現できることが明らかになった。
一方、主鎖をPMMAとし弱酸型光酸発生基を側鎖に有する新規ポリマーの合成に成功、特定の条件で光応答水和性を示すことを観察したが、細胞の脱着制御を実現する条件特定には至らなかった。また、別の光細胞操作手段として検討したジアリールエテン誘導体（龍谷大学内田欽吾教授提供）について、光細胞毒性を光スイッチングする所見を得た。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
パターン光照射による細胞単層の切断・選択剥離操作は、当初の研究計画では強酸型・弱酸型の両PAGポリマーを組み合わせることで、最終年度までに実現することを想定していたが、弱酸型モノマーが重合阻害性を有することが明らかになり、強酸型PAGポリマーと他のポリマーの組み合わせの検討に切り替えた、その結果、MDCK及びNIH/3T3の細胞単層を処理可能な基材調製・操作条件が見出されるに至った。
上述の通り遅れていた弱酸型PAGポリマーの開発については、適当な保護基を用いることで重合阻害の問題を克服し、ようやくいくつかの導入率のPMMAを合成、これを用いた細胞の脱着制御には至っていないものの、顕著な光応答水和性を示す条件が見出され、光構造変化に伴う弱酸発生が細胞に全くダメージを与えないことも確認された。
さらに、強酸型PAGポリマー層上に形成された架橋ハイドロゲル層の剥離を光照射によって誘起するという、当初想定していなかった知見を得ることが出来、精密な細胞パターニングのほか、これまでにないゲル構造体を形成する新手法としての応用が示唆されるに至っている。また、当初の計画で想定してなかった光細胞操作手段として検討したいくつかのジアリールエテン誘導体について、２種類の構造から、それぞれ異なるメカニズムで光細胞毒性を光スイッチングする所見を得た。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の最終目標としていたパターン光照射による細胞単層の切断・選択剥離操作が、強酸型PAGポリマーのみを用いて実証されるに至ったが、特定の細胞種に限定されていること、酸によるダメージの懸念など、若干の課題も残されている。細胞へのダメージ低減を意図して検討した弱酸型PAGポリマーは、初年度の段階で開発の難航が示唆されたが、適当な保護基を用いることで問題を克服することが出来た。このポリマーはこれまで用いてきた強酸型とは異なり、酸による細胞のダメージがない上、低分子成分を発生しない新規のポリマー材料であり、PMMA主鎖のラインナップについては、細胞接着の光応答は実現されていないものの、この基本構造は、今後バイオ系への更なる応用が期待できる。来年度以降の細胞接着制御の実現に向け、より水和性の主鎖への導入を検討する予定である。
また、新たに見出された架橋ハイドロゲル構造体の新規形成技術については、マイクロパターン照射による光架橋（現像）と光剥離の両方の組み合わせで実現しうる様々な微小構造体の形成を試み、新しい細胞培養系への応用などを検討していく。
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| Causes of Carryover |
計画時、初年度購入を予定しながら、申請後、本研究開始前に更新したクロマトカラムに相当する額を初年度から繰り越したが、本研究にも使用できる状況にあったため、本年度内の購入を差し控えた。他については年度当初に想定した程度の額を使用、その結果、初年度の繰り越し分程度次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
新たに開発した弱酸型PAGポリマーについて、様々な主鎖との組み合わせ、導入率、脱保護率などを振って、物性解析を行うとともに、細胞操作への応用検討を本格化する。さらに、当初の計画になかった、ハイドロゲルの微小構造体の形成及び応用の検討にも費用を費やすことになるが、繰り越し金の効率的な使用および進捗状況に応じた購入物品の精査により、資金不足による停滞を回避し研究を遂行する。
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