2013 Fiscal Year Annual Research Report

GDSLリパーゼによるピレスリン生合成の分子機構解明と昆虫抵抗性植物作出への応用

Research Project

Project/Area Number	25282234
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
Research Institution	Kinki University
Principal Investigator	松田一彦近畿大学, 農学部, 教授 (00199796)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	平竹潤京都大学, 化学研究所, 教授 (80199075) 松井健二山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (90199729)
Project Period (FY)	2013-04-01 – 2016-03-31
Keywords	除虫菊 / ピレスリン / 生合成 / GDSLリパーゼ
Research Abstract	除虫菊(Tanacetum cinerariifolium)は殺虫性物質ピレスリンを生合成し、昆虫による食害から身を守る。申請者はピレスリンのエステル結合の形成を触媒する酵素として除虫菊のGDSLリパーゼの一種(TcGLIPと命名)が関与することを発見したが、本酵素の触媒機構、調節因子および他の植物での関連酵素の役割については不明であった。そこでまず、Ｘ線結晶構造解析を目的としてTcGLIPの発現・精製条件について検討した。これまで本酵素は大腸菌BL21(DE3)pLysS株で発現させ、Amylose resinとMono Qカラムを用いて精製していたが、その方法では十分な酵素量を確保することが不可能であった。そこで、大腸菌株をOrigamiB(DE3)pLysSに変更したところ、本酵素の収量が飛躍的に向上した。また、TcGLIPを発現する際に融合させたマルトース結合タンパク質(MBP)は触媒作用に影響しないことも確認した。一方、TcGLIPに対する自殺基質タイプの阻害剤の合成を試みた。すなわち、benzyl carbamate を出発原料として用いて、ホルムアルデヒドを亜リン酸トリフェニルと縮合させることによってdiphenyl [(benzyloxycarbonyl)aminomethyl]phosphonateを合成し、接触水素添加によってベンジルオキシカルボニル基を除去後、亜硝酸ナトリウムによりジアゾ化し、銅触媒の存在下でカルベンを発生させ、2.5-dimethylhexa-2.4-diene の二重結合への付加によりシクロプロパン環化し、ホスホン酸ジフェニルエステル型阻害剤を合成した。さらにTcGLIPの類縁酵素の植物普遍的な役割を解明するため、TcGLIPホモログ遺伝子を破壊したシロイヌナズナを作出した。それらは２６年度の種々の実験に使用される。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 研究開始当初、除虫菊のピレスリン生合成酵素TcGLIPの過剰発現に成功したものの、精製した本酵素の量は結晶条件を網羅的に探索するために十分な量を確保できていなかった。しかし、発現に用いる大腸菌の種を精査した結果、本酵素を所定の濃度で多量に得る条件を見つけることができた。また、TcGLIP阻害剤の合成ルート構築も達成した。これらの成果を総合して、おおむね良好に研究は進展したと判断した。
Strategy for Future Research Activity	２５年度に実施された研究によって、期待通り多量かつ均一な性質をもつTcGLIPを調製することが可能となり、阻害剤も得られたことをふまえて、本研究の中心的課題であるＸ線結晶構造解析に挑む。また、本酵素に関連する酵素群の植物普遍的な役割について明らかにする。